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包含多肽的多层膜、涂层和微粒的制作方法
来自 : www.xjishu.com/zhuanli/26/2006
发布时间：2021-03-25
专利名称：包含多肽的多层膜、涂层和微粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过静电叠层自组装(\"ELBL〃)在适当表面上形成超
薄多层膜。更具体的，本发明涉及用于设计多肽的方法，所述多肽 用于通过ELBL纳米加工薄膜、涂层和微囊，应用于生物医药和其他 领域。
背景技术：
ELBL是已经建立的技术，其中超薄膜通过改变带相反电荷的聚 电解质的吸附而被组装。该过程是基于在每层沉积之后薄膜表面电 荷的逆转。图1显示了一般的ELBL过程的示意图带相反电荷的聚 离子(阳离子聚离子10和阴离子聚离子11)的薄膜在负电性平面 12上逐层组装；表面电荷在每层沉积之后逆转。重复该过程直至形 成所需厚度的薄膜。结合的物理基础是静电学和抗衡离子释放入溶 液后的熵增加，重力和核力实际上没有起作用。因为该过程的通用 性和相对简单性，ELBL允许很多不同类型的物质在很多不同类型的 表面上沉积。因此，存在大量可能有用的物质和表面的组合。关于 ELBL的综合性讨论包括它的历史参见YuriLvov， \"Electrostatic Layer-by-Layer Assembly of Proteins and Polyions〃 in Protein Architecture: Interfacial Molecular Assembly and Immobilization Biotechnology, Y. Lvov H. M6hwald eds. (New
York: Marcel Dekker， 1999)， pp.125- 167，其在这里通过引用整 体并入本文。
ELBL最近己经成为纳米技术领域的焦点，因为它可以被用来制 造厚度大致小于1微米的薄膜。另外，ELBL允许对薄膜制造过程的 特殊控制，实现了纳米级材料的使用，并允许纳米级的结构修饰。 因为每层的厚度都在几纳米或更少的层次上，取决于所使用的材料 的类型和特定的吸附过程，所以能够形成可精确重复厚度的多层组 装。
许多合成的聚电解质己经在ELBL应用中被采用，包括聚(苯乙 烯磺酸)钠(〃PSS〃)、聚(丙烯胺盐酸)(\"PAH〃)、聚(二甲基二烯 丙基氯化铵)(〃PDDA〃)、聚(丙烯酰胺-共-二甲基二烯丙基氯化铵)、 聚(乙烯亚胺)(〃PEI〃)、聚(丙烯酸)(〃PAA〃)、聚(茴香烯磺酸)、 聚(乙烯磺酸盐)(〃PVS〃)和聚(乙烯磺酸)。然而，这类物质并非普 遍用于生物医学应用，因为它们是抗原性或毒性的。
蛋白质，作为带有具有可电离基团的侧链的聚合物，能够在用于 各种应用的ELBL中使用，包括生物医学的应用。已经在ELBL中使 用的蛋白质的例子包括细胞色素d鸡蛋蛋清溶菌酶、免疫球蛋白G、 肌红蛋白、血红蛋白和血清白蛋白(^uV)。然而，对于使用蛋白 质用于该目的还存在困难。这些包括对多层结构的有限的控制(因 为蛋白质表面是高度不规则的且蛋白质一般不会吸附于规则结构的 表面)，对pH的限制(由于pH依赖性的蛋白质溶解度和结构稳定
性)，当使用外源性蛋白时缺乏生物相容性，和放大生产的成本(如 果基因还没有被克隆)；除非所述蛋白质在容易获得的来源(例如， 母牛)中是相同的，否则蛋白质将必须从它预期应用的生物体中获 得，这使得蛋白质的大规模生产的成本是禁止性的。
对比多肽，其一般比蛋白质小且比较不复杂，构成极好的一类用 于ELBL组装的材料，而且通过ELBL制造的多肽薄膜结构将有用于 广泛的应用。本发明提供了通过ELBL用于薄膜、涂层和微囊的纳米 加工的多肽的设计方法。使用本发明方法设计的多肽将表现几个有 用的性质，包括但不限于完全确定的一级结构、在水溶液中最低
限度的二级结构、单分散性、每单位长度完全受控制的净电荷、根 据需要形成交联的能力、逆转交联形成的能力、形成更有组织的薄 膜(比使用蛋白质可能形成的)和相对廉价的大规模生产成本(假 定基因设计、合成、克隆和宿主表达于大肠杆菌(E C^i)或酵母 中，或者肽合成)。
使用本发明方法设计的多肽已经显示有用于薄膜结构的ELBL， 所述薄膜结构在生物医学技术、食品技术和环境技术中具有定向或 可能的应用。这类多肽可以用来例如制造人工红细胞、给药装置和 抗微生物薄膜。
发明内容
本文公开了包含两层或更多层聚电解质的多层S臭其中相邻层包 含带相反电荷的聚电解质。第一层聚电解质包含复合多肽，所述复 合多肽包含与一个或多个功能区共价连接的一个或多个表面吸附 区，所述功能区生成单个多肽链，其中所述复合多肽和所述一个或 多个表面吸附区具有相同的极性。其中所述一个或多个表面吸附区 包含一个或多个氨基酸序列基序，所述基序由5至15个氨基酸残基 组成并且在中性pH下每个残疾具有大于或等于0. 4的净电荷强度。 所述一个或多个功能区包含3至约250个氨基酸残基。所述复合多 肽不是均聚物，长度至少为15个氨基酸残基，并且在pH4至10范 围内具有大于50 pg/mL的水溶解度。而且，第二层包含第二层聚电 解质，所述第二层聚电解质包含聚阳离子材料或聚阴离子材料，所 述聚阳离子材料或聚阴离子材料具有大于1,000的分子量和每分子 至少5个电荷，以及一个与所述第一层聚电解质相反的电荷。
一种生产多层膜的方法，所述膜包含第一层和第二层，其中相邻 层包含带相反电荷的聚电解质，所述方法包括共价结合一个或多 个表面吸附区与一个或多个功能区以生成复合多肽，其中所述复合 多肽和所述一个或多个表面吸附区具有相同极性；以及将所述复合 多肽沉积在基质或第二层上，以形成第一层。当沉积步骤包括将所
述复合多肽沉积在基质上时，所述方法进一步包括将所述第二层聚 电解质沉积在所述第一层上。
本发明还提供了用于在氨基酸序列信息中识别用于在ELBL中使 用的具有确定长度和中性pH下的净电荷的\"序列基序\"以及用于记录 所需数目的基序的新方法。所述方法包括步骤(a)获得来自特定 生物体的肽或蛋白质的氨基酸序列；(b)定位所述氨基酸序列中的 起始氨基酸；(c)检査所述起始氨基酸和所述随后n个氨基酸以确 定具有与所述某一极性相反的极性的荷电氨基酸的数目；(d)如果 具有与所述某一极性相反的极性的所述荷电氨基酸的数目是一或更 多，从步骤g继续该方法；(e)检查所述起始氨基酸和所述随后n 个氨基酸以确定具有所述某一极性的荷电氨基酸的数目；(f)如果 具有所述某一极性的荷电氨基酸的数目等于或大于 记录由所述起 始氨基酸和所述随后n个氨基酸组成的所述氨基酸序列基序；(g) 定位所述氨基酸序列中另一个起始氨基酸；和(h)从步骤c开始 重复所述方法直至所述所需数目的氨基酸序列基序已经被识别或者 所述氨基酸序列中的所有氨基酸已经作为步骤c中的所述起始氨基 酸被使用；其中x大于或等于约1/2 n。
本发明还提供了用于设计用于在ELBL中使用的多肽的新型方 法，包括步骤(a)使用前段提到的步骤来识别并记录一个或多个 具有某一极性的净电荷的氨基酸序列基序和(b)连接多个所述被记 录的氨基酸序列基序以生成多肽。
本发明还提供了用于设计在ELBL中使用的多肽的新型方法，包 括如下歩骤(a)重新设计多个氨基酸序列基序，其中所述氨基酸 序列基序由n个氨基酸组成，其中至少x个氨基酸是带正电且没有 一个氨基酸是带负电，或者其中至少x个氨基酸是带负电且没有一 个氨基酸是带正电，其中x是大于或等于约1/2 n;和(b)连接所 述多个所述氨基酸序列基序。氨基酸序列基序可以包含20个普通氨 基酸或非天然氨基酸，所述氨基酸可以是左旋(L-氨基酸)也可以 是右旋(D-氨基酸)。
本发明还提供了一种薄膜，该薄膜包括多个多肽层，所述多肽层
具有交替的电荷，其中所述多肽包含至少一个由n个氨基酸组成的 氨基酸序列基序，其中至少x个氨基酸带正电且没有一个氨基酸带 负电，或者其中至少x个氨基酸带负电且没有一个氨基酸带正电，
其中x大于或等于约1/2 n。这些多肽中的基序可以使用上述任一方 法来选择。
本发明还提供了使用半胱氨酸或其他含巯基的氨基酸类型来\"锁 定(lock)\"和\"解锁(unlock)\"多肽ELBL薄膜多层的方法。该方法
使薄膜在极端PH下保持稳定，对由所设计的多肽纳米加工的薄膜的 机械稳定性和扩散性质产生较强控制并增加了它们在广泛应用中的 效用。
图1是一般ELBL过程的示意图。
图2是使用本发明方法在人类氨基酸序列信息中识别的氨基酸
序列基序的累积二级结构倾向性图，与105个随机氨基酸序列的结构
倾向性分布相比较。
图3 (a)显示了由石英晶体微量天平技术rQCM\")所监测到的关
于根据本发明设计的氨基酸序列组合的吸附数据。
图3 (b)显示了由QCM监测到的关于根据本发明设计的不同氨
基酸序列组合的吸附数据的比较。
图3 (c)显示了关于根据本发明设计并制造的氨基酸序列的吸
附质量(纳克)与层数的图。
图4 (a)描述了根据本发明半胱氨酸锁定方法的内层二硫键。 图4 (b)描述了根据本发明半胱氨酸锁定方法的中间层二硫键。 图4 (c)描述了由根据本发明方法设计的多肽所制造的微囊中
二硫键的氧化和还原。
图5是用于识别现有氨基酸序列信息中具有适当的静电性质用
于ELBL的氨基酸序列基序的本发明的选择方法的示意图。
图6显示了在可获得的人类氨基酸序列数据中识别的非多余序 列基序的数目。
图7显示了来自水性介质的聚L-谷氨酸和聚L-赖氨酸的ELBL吸 附，作为离子强度的函数。
图8显示了根据本发明方法设计的多肽的吸附，用于实验以探测
二硫键形成的效果。
图9显示了在参考图8所讨论的酸性pH下的薄膜分解过程中材
料保留的百分比。
图10显示了在涉及重新设计的含有半胱氨酸的多肽的实验的酸 性PH分解步骤中材料损失的百分比。
图ll (a)描述了肽的溶液结构在薄膜组装上的作用，显示了聚 L-谷氨酸和聚L-赖氨酸的组装行为是如何依赖pH的。针对吸附层标 绘出QCM共振频率。聚L-谷氨酸的平均分子量是84600 Da，而聚L-赖氨酸的平均分子量是84000 数字指的是pH值。E=Glu， K=Lys。 用于组装的肽浓度是2 mg/mL。
图ll (b)描述了肽的溶液结构在薄膜组装上的作用，显示了聚 L-谷氨酸和聚L-赖氨酸的溶液结构是如何依赖pH的。平均摩尔残基 椭圆率被标绘为pH的函数。肽浓度是0.05 mg/mL。
图12显示了不同长度的聚电解质的吸附数据，说明长的聚电解 质比短的吸附更好。
图13描述了 \"复合\"多肽(4)的实施方案，包含两个表面吸附 (1， 2)区和一个功能区(3)。每个表面吸附区(1， 2)包含一个或多个基 序。
图14描述了通过溶液相合成、固相合成或重组肽生成来制备复 合多肽(4)的三个不同区(1，2， 3)。
图15描述了复合肽(4)的三个区(1，2， 3)通过肽合成而结合生成 一个多肽链。结合该实例三个区的其他方法是可能的。
图16描述了 3T3成纤维细胞在具有不同表面涂层的盖玻片上3 天后的增殖程度。PLL指15层聚(L-谷氨酸)(PLGA)和聚(L-赖氨酸) (PLL) 。 PLL/RGD指10层PLGA/PLL，加5层含RGD的肽，而RGD指
15层含RGD的肽。涂层通过叠层组装制备，每种情况中的末端层具 有净正电荷，未涂布的盖玻片作为对照。涂布表面显示比未涂布表 面更大的增殖程度，用PLL/RGD涂布的表面显示最大的增殖。
图17描述了 \"复合\"多肽的实施方案，包含两个表面吸附区 (120和130)和一个功能区(110)。
图18(200)描述了 \"复合\"多肽的实施方案，包含两个面吸附区 (120和130)和一个功能区(111)，连接至表面(150)。
具体实施方式
术语解释
为了在随后描述中的方便，采纳术语的以下解释。然而，这些解 释仅仅意为示例性的。它们不是意欲当术语在整个说明书中被描述 或提及时来限制这些术语。更正确的，这些解释意味着要包括如这 里所描述或主张的术语的其他方面和/或例子。
本文使用的\"层\"表示经过吸附步骤后在例如薄膜形成模板上 的薄膜厚度增加。\"多层\"表示多个(即，两个或更多)厚度增加。\"聚 电解质多层薄膜\"是包含一个或多个聚电解质厚度增加的薄膜。沉积 后，多层薄膜的层不可以保持为分离的层。事实上，可能存在明显 的物类掺混，特别是在厚度增加的界面。
本文使用的\"生物相容性\"表示在摄食、皮肤接触或引入血液后没 有引起不利的健康影响。
本文使用的\"免疫应答\"表示人类免疫系统对血液中物质存在的 响应。免疫应答能以多种方式表征，例如，通过增加血液中识别某 一抗原的抗体的数目(抗体是由免疫系统生成的蛋白质，抗原是引发 免疫应答的实体)。人体通过增加血液中抗体的数目来对抗感染和抑 制再感染。特异性免疫应答在一定程度上取决于个体，尽管普遍的 应答模式是标准的。
本文使用的\"表位\"表示被抗体识别的蛋白质的结构。通常，表位 将位于蛋白质的表面上。\"连续表位\"是包括成排的几个氨基酸的表 位，不是包括与折叠蛋白质发生接触的氨基酸残基的表位。
本文使用的\"序列基序\"和\"基序\"表示使用本发明方法识别的给 定残基数目的氨基酸序列。在优选实施方案中，所述残基数目是7。
本文使用的\"氨基酸序列\"和\"序列\"表示至少两个氨基酸残基长 度的任意长度的多肽链。
本文使用的\"残基\"表示聚合物中的氨基酸；这是由此形成所述聚
合物的氨基酸单体的残基。多肽合成包括水解，即，在氨基酸加入 多肽链时\"丢失\"单个水分子。
本文使用的\"设计的多肽\"表示使用本发明方法设计的多肽，术语 \"肽\"和\"多肽\"被互换使用。
本文使用的\"一级结构\"表示多肽链中线性的氨基酸序列，\"二级 结构\"表示由非共价相互作用(通常为氢键)包括稳定的或多或少有
规则的结构类型一例子包括a-螺旋、|3-折叠和(3-转角。
本文使用的\"氨基酸\"不限于20种通常天然存在的L-a-氨基酸； 如上下文许可，该术语还指L-氨基酸、D-氨基酸和其他非天然氨基 酸。
本文使用的\"非天然氨基酸\"表示不同于20种天然存在的氨基酸 的氨基酸。
\"类肽\"或N-取代甘氨酸表示相应的氨基酸单体的类似物，具有 与相应氨基酸相同的侧链，但是该侧链附于氨基氮原子而非残基的 a-碳。因此，聚类肽中单体间的化学键合不是肽键，这可以用来限 制蛋白水解消化。
\"基质\"表示具有供水溶液中聚电解质吸附的适当表面的固体材 料。基质表面可以具有实际任何形状，例如平面、球形、柱形等。 基质表面可以是规则或不规则的。基质可以是结晶的。基质大小范 围从纳米尺度至大尺度。而且，基质任选包含胶粒聚集。基质可以 由有机材料、无机材料、生物活性材料或其组合制成。基质硅晶片 的非限制性实例；荷电胶粒，例如CaC03或三聚氰胺甲醛的微粒；生 物细胞例如红细胞、肝细胞、细菌细胞或酵母细胞；有机聚合物晶 格，例如聚苯乙烯或苯乙烯共聚物晶格；脂质体；细胞器；和病毒。
在一个实施方案中，基质是医疗装置，例如人工起搏器、耳蜗植入 物或支架。
当基质在薄膜形成过程中或之后分解或以其他方式去除时，其被 称为\"模板\"(用于薄膜形成)。模板颗粒可以溶解于适当溶剂或 者通过热处理去除。例如，如果使用部分交联的三聚氰胺甲醛模板 颗粒，则所述模板可以通过温和的化学方法分解，例如用二甲亚砜
(DMSO)或通过pH值变化。模板颗粒溶解后，留下由交替聚电解质层 构成的中空多层壳。
〃微囊\"是中空壳或核心外涂层形式的聚电解质薄膜。所述核心包 含多种不同的密封剂，例如蛋白质、药物或其组合。
\"生物活性分子〃表示具有生物效应的分子、大分子或大分子组 装。具体的生物效应可以以适当测定法测量，来测量所述生物效应 并标准化为每单位重量或每分子生物活性分子。生物活性分子可以 封装或保留在多肽膜内。生物活性分子的非限制性实例是蛋白质、 蛋白质的功能片断、蛋白质复合物、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖 体、活性治疗剂、磷脂、多糖。本文使用的〃生物活性分子\"还包括 生物活性结构，例如功能膜片断、膜结构、病毒、病原体、细胞、 细胞聚集物和细胞器。可被封装或保留在多肽膜内的蛋白质的实例
是血红蛋白；酶，例如葡萄糖氧化酶、尿素酶、溶菌酶等；细胞 外基质蛋白，例如纤维结合蛋白、层粘连蛋白、玻璃体结合蛋白和 胶原；和抗体。可封装或保留在多肽膜内的细胞的实例是移植的胰 岛细胞、真核细胞、细菌细胞、植物细胞和酵母。
本文使用的可溶性多肽在pH 7. 0水溶液中具有大于50吗/mL的 溶解度。在另一实施方案中，可溶性多肽在pH7.0下具有大于或等 于约1 mg/mL的水溶解度。
下述三字母简称在这里用来代表20种普通氨基酸
Ala二赖氨酸 Cyr半胱氨酸 Asp^天冬氨酸
Gli^谷氨酸 Phe二苯丙氨酸 Gly二赖氨酸
His二组氨酸 Ile二异亮氨酸 Lyr赖氨酸 Leu二亮氨酸 Prc^脯氨酸 Ser二丝氨酸 Trp二色氨酸
Met二蛋氨酸 Gl『谷氨酰胺 ThF苏氨酸 Ty^酪氨酸
As『天冬酰胺
Arg二精氨酸
Val4领氨酸
A.发明描述
本发明包括包含带相反电荷的聚电解质交替层的多层薄S莫其中 所述薄膜的第一层包含设计的多肽。\"设计的多肽\"表示包含一个或 多个氨基酸序列基序的多肽，其中所述多肽长度为至少15个氨基 酸，并且在pH7.0下，相同符号荷电残基的数目减去相反符号的残 基数目，与多肽总残基数目的比值大于或等于0.4。换言之，每个残 基的净电荷强度大于或等于0.4:在另一实施方案中，在pH7.0下，
相同符号荷电残基的数目减去相反符号的残基数目，与多肽总残基 数目的比值大于或等于0.5。换言之，每个残基的净电荷强度大于或 等于0.5。在一个实施方案中，设计的多肽不是均聚物。
在一个实施方案中，聚电解质包含具有大于1， 000的分子量和每 分子至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料。在一个实施方 案中，聚阳离子材料包含聚胺，例如多肽、聚乙烯胺、聚(氨苯乙烯)、 聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯 酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-交联羧甲基纤维素 二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基-甲 基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基 甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚 胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯 氯化物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵)、壳聚糖以及包含一 种或多种前述聚阳离子材料的组合物。在另一实施方案中，聚阴离 子材料包含多肽、核酸、藻酸盐、角叉菜胶、帚叉藻聚糖、果胶、 黄原胶、透明质酸、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、 硫酸葡聚糖、聚甲基丙烯酸、氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多
糖、交联羧甲纤维素、含有侧链羧基的合成聚合物和共聚物，以及 包含一种或多种前述聚阴离子材料的组合物。
本发明还提供了用于通过ELBL纳米加工薄膜、涂层和微囊的多 肽的设计方法，用于在生物医学和其他领域的应用。所述方法包括5 个主要的设计，其关注(1)多肽的静电性质；(2)多肽的物理 结构；(3)从多肽制造的薄膜的物理稳定性；(4)多肽和薄膜的 生物相容性；和(5)多肽和薄膜的生物活性。第一个设计关注，静 电学，可能是最重要的，因为它是ELBL的基础。没有适当的电荷性 质，多肽将不溶于水溶液中并不能用于薄膜的ELBL纳米加工。我们 已经设计了新型的方法，用于识别氨基酸序列信息中具有适合于 ELBL的静电性质的氨基酸序列基序。
用于ELBL的多肽的二级结构也是重要的，因为薄膜的物理性 质，包括它的稳定性，将取决于肽的溶液结构如何转变为它在薄膜 中的结构。图11描述了某些多肽的溶液结构如何与薄膜组装相关。 (a)显示了聚L-谷氨酸和聚L-赖氨酸的组装行为是如何依赖pH 的。显然，oi-螺旋构型与沉积材料的相关程度高于卩-折叠构型。这 一行为的精确分子解释有待阐明。(b)显示这些肽的溶液结构是如 何依赖pH的。在pH4.2时，聚L-谷氨酸大多是or螺旋，如同聚L-赖氨酸在pH 10. 5时。两种多肽在pH7. 3时都是大多为无结构的线 团状构型。
余下的关注涉及多肽薄膜的应用。在实施本发明中，将根据特定 应用的设计要求将或多或少的权重放在这些其他关注上。
通过使用本发明的选择方法以在氨基酸序列信息中识别具有适 当的电荷特征的氨基酸序列基序并利用其他设计关注以选择特定基 序，能够设计适合于ELBL制造应用于生物医学和其他领域的纳米结 构薄膜的多肽。或者，可以使用本发明的方法来重新设计用于在ELBL 中使用的多肽。所述重新设计的方法基本上与在现有氨基酸序列信 息中识别基序的方法相同，除了氨基酸序列基序中每个残基是由实 施人员选定而非在特定生物体的基因组或蛋白组信息中被识别的完 整基序。必须强调的是，关于新生多肽的设计，本发明所举出的基
本的多肽设计原则不依赖于所涉及的氨基酸是否为20种普通天然存 在的氨基酸、非天然氨基酸或它们的一些新型组合。而且，其他D-
氨基酸和L-氨基酸都能够被使用。
本发明的设计关注在下面更详细的讨论。 1.静电学
我们已经设计了用于在氨基酸序列信息中识别具有适合用于
ELBL的静电性质的氨基酸序列基序的方法。使用该方法，我们己经 在人类蛋白质组数据一编码人体中所有已知蛋白质的基因组的蛋白 质翻译一中识别了 88315个非多余氨基酸序列基序。该信息可通过 美国国立生物技术信息中心(\"NCBI〃)网 站http:〃ww. ncbi. nlm. nih. gov等公开获得。这类信息随人类基 因组的进一步分析而被经常更新。随着这类信息的增加，在人类序 列信息中通过本发明的选择方法能够被识别为具有用于ELBL的适当 的静电性质的氨基酸序列基序的数目也将增加。对于任何生物体而 言都是同样的。被接受的生化和物理学原理以及下面描述的实验结 果表明，被识别的序列基序将对于用于ELBL结构的纳米加工的多肽 的设计是有用的。
关键的选择标准是在中性pH (pH7，接近人类血液的pH)下每单
位长度的平均电荷。另外，有几个结构的优选。首先，优选的是每 个氨基酸序列基序由仅7个残基组成。 a.基序中残基的总数
在优化生物相容性、物理结构和非多余序列基序数目的努力中， 长度为7的基序在可获得的氨基酸序列数据中被选择。
如下所讨论的，氨基酸序列基序上每个残基的净电荷强度大于或 等于0.4。在一个实施方案中，每个序列基序中至少半数氨基酸残基 是荷电的，这样，氨基酸序列基序上每个残基的净电荷强度大于或 等于0.5。而且，优选但非必须的，每个基序的所有荷电残基具有相 同电荷。这些要求保证了每个基序可充分溶解于水溶剂，并在中性 pH下具有足够的电荷用于ELBL。因为只有相对小比例的氨基酸类型 是带电的，当给定氨基酸序列长度增加时，所述序列具有足够比例
的适当荷电氨基酸用于ELBL的几率降低。对于大小为7的基序，4 个荷电氨基酸是优选最低限度的，因为少于4个电荷，产生实质降 低的肽溶解度和降低的对ELBL的控制。
关于生物相容性(下面进一步讨论)，每个被识别的序列基序是 足够长的以在7个残基上构成连续表位(相关于设计的肽可能被引 入其中的生物体的可能的免疫应答)，但不是长至完全符合在蛋白 质表面上和其内部的残基；电荷要求帮助确保序列基序在折叠蛋白 质的表面出现；荷电残基不能形成于折叠蛋白的核心。相反，非常 短的基序可能对于机体而言是随机的序列或者非特别\"自我\"的序 列，并因此引发免疫应答。尽管用于生成抗体的肽的理想长度是一 些争论点，但大部分肽抗原的长度范围从12至16个残基。9个残基 或更短的肽可以是有效的抗原；长于12或16个氨基酸的肽可以含 有多个表位(Angeletti， R. H. (1999) Design of Useful P印tide Antigens, / ^j\'o历o丄7fec力.10:2-10，其因此通过引用整体并入 本文)。因此，为最小化抗原性，可以优选短于12以和更好的短于9 个残基的肽。
优选的基序不应该太长的另外一个原因为最小化二级结构的形 成。二级结构降低了多肽(见下文)和由它们制成的薄膜的物理结 构的控制。因此，氨基酸序列基序应该含有5至15个连续氨基酸。
而l当每个基序的残基数目为7时发现了最大数目的非多余基 序。图6显示了在可获得的人类氨基酸序列信息中的非多余基序的 数目。阳性基序的最大数目是对于5个氨基酸长度，而阴性基序的 最大数目是对于7个残基长度。阳性和阴性基序的最大数目对于5 和7是大约相同的。因此，7个残基的基序长度似乎将最大化非多余
基序的数目。
由于所有的上述原因，7个残基是以优化用于ELBL的多肽设计 的优选的基序长度。然而，有可能在一些情况下，稍微更短的或稍 微更长的基序也将同样起作用。例如，可以采用5或6个残基长度 的基序，而长度处于8-15个残基级别的基序也可能是有效的。因此， 7个残基的基序长度似乎将最大化非多余基序的数目。
b.荷电残基的数目
第二，优选地至少4个荷正电的(碱性的)氨基酸(Arg、 His或 Lys)或至少4个荷负电的(酸性的)氨基酸(Glu或Asp)在中性pH 下存在于每个7残基的基序中。在致力于保证中性pH下足够高的电 荷密度时，不赞成正电荷和负电荷的组合。然而，同时含有阳性氨 基酸和阴性氨基酸的基序可能用于ELBL。例如，稍微更长的(约9 个残基)基序可以具有6个荷正电的氨基酸和1个荷负电的氨基酸。 重要的是净电荷强度(即，静电荷的绝对值)一整个肽必须在中性PH 下是或者足够荷正电或足够荷负电的。然而，所述基序的优选的实 施方案将只含有Glu或Asp或者只含有Arg、 His或Lys作为荷电氨 基酸(尽管其他非荷电氨基酸可能并且通常是形成基序的部分)， 除非非天然氨基酸被允许作为酸性或碱性氨基酸。
图5是显示在用于识别具有适当的静电性质的氨基酸序列的选 择过程中所涉及的步骤的流程图。假定只有20种普通氨基酸被涉 及。如果寻找荷负电的基序，所述过程从定位序列数据中的氨基酸 开始。该氨基酸将被称为\"起始氨基酸\"，因为它是用于分析周围氨 基酸的起始点(即，它将开始所述基序)。接下来，对起始氨基酸 和随后6个残基检查Arg、 His或Lys的出现。如果一个或多个Arg、 His或Lys位于这7个氨基酸中，该过程在另一个起始氨基酸重新开 始。如果没有发现Arg、 His或Lys，对这7个氨基酸检査以确定Glu 和/或Asp出现的数目。如果Glu和/或Asp在这7个残基中出现至 少4次，则该序列基序被编入目录。所述选择过程对荷正电的氨基 酸基本相同，除了分别地Glu和Asp被Arg、 His和Lys所取代以及 Lys被Glu和Asp所取代之外。显然，也可以在氨基酸序列的起始端 (氨基末端)开始该方法并进行至结束端(羧基末端)，或者，可 选地，可以在随机位点开始并随机地或者系统地以任一方向完成序 列中所有的氨基酸。而且，可以使用该方法来识别序列信息中含有 非天然氨基酸的基序，例如，如果密码子被用来代表各非天然氨基 酸类型。在这种情况下，可以搜寻分别代替Glu和Asp以及Arg、 Lys 和His的非天然的酸性或碱性氨基酸。
在一个实施方案中， 一个或多个第一氨基酸序列基序由5至15
个氨基酸组成，其中所述第一氨基酸序列上每个残基的净电荷强度
大于或等于0.4。另一实施方案中， 一个或多个第一氨基酸序列基序 由n个氨基酸组成，其中在pH7时所述第一氨基酸序列上每个残基 的净电荷强度大于或等于约1/2 n，并且其中n为5至15。
其余的设计关注，即物理结构、物理稳定性、生物相容性和生物 功能性，主要涉及将使用设计的多肽的特定应用。如上所述，将根 据特定应用所需的肽性质在设计过程中或多或少地权衡这些关注。
2.物理结构
关于氨基酸序列基序的一个设计关注是它们形成二级结构的倾 向性，特别是or螺旋或P-折叠。我们已经在几个途径寻求控制、显 著最小化所设计的多肽在含水介质中的二级结构，以最大化对薄膜 层制造的控制。首先，优选地所述序列基序是相对短的，因为长基 序更容易在溶液中采用稳定的三维结构。第二，我们在多肽设计的 优选实施方案中的每个基序之间设置了甘氨酸残基。甘氨酸具有非 常低的cx-螺旋倾向性和非常低的P-折叠倾向性，使其积极地非常不 利于甘氨酸和其邻近氨基酸在水溶液中形成规则的二级结构。脯氨 酸在一些方面具有类似的性质并能够作为甘氨酸的替代物被用来连 接基序。第三，我们已经寻求最小化所设计的多肽自身的a-螺旋或 卩-折叠倾向性，通过关注累积a-螺旋倾向性小于7. 5和累积p-折叠 倾向性小于8的基序(\"累积\"倾向性表示基序中所有氨基酸的or螺 旋或P-折叠倾向性的总和)。然而，在一些情况下，具有高几分的累 积(X-螺旋倾向性和/或(3-折叠倾向性的氮基酸序列将可能适合用于 ELBL，因为基序间的Gly (或Pro)残基将在抑制稳定的二级结构在 所设计的多肽形成中起关键作用。事实上，在某些应用中可能希望 多肽的倾向性以形成相对高级的二级结构作为薄膜制造的特殊设计 特征；如上所述，依然必须满足对ELBL的必要的静电电荷要求。
为了能够选择具有所需二级结构倾向性的氨基酸序列，我们首先 使用Chou和Fasman的方法(见P. Chou和G. Fasman历oc力e肌\'W/y 13:211 (1974)，其全部内容通过引用并入本文)为全部20个氨基酸
计算了二级结构倾向性，利用来自超过1800个高分辨率的X射线晶 体结构的结构信息(1334个含有a-螺旋和1221含有p折叠股 (P-strands))。结构选自蛋白质数据库(Protein Data Bank,公 共可获得的蛋白质结构库)，基于(a)结构测定方法(X-射线衍射)； (b)分辨率(好于2.0A)—这里的\"分辨率\"指如在Rayleigh标准中 能够分辨的最小尺寸；和(c)结构多样性(被用来计算各种氨基酸的 螺旋和折叠倾向性的蛋白质晶体结构之间少于50%的序列同一性)。 其原理是选择由最可靠的方法学所确定的高分辨率结构并通过具有 相似结构而不偏移倾向性计算。接下来，使用个人计算机中的随机 数字发生器生成100000个非多余性随机序列用于比较。然后，我们 计算了使用上面(A) (l)部分中描述的选择方法所识别的88315个氨 基酸序列(59385个非多余性碱性序列基序和28930个非多余性酸性 序列基序)的二级结构倾向性。然后将所述随机序列的倾向性与所 选择的序列的倾向性进行比较。图2显示了在这些序列基序中的二 级结构形成的分布。图2中的矩形突出了我们已经识别为最小限度 可能形成基于二级结构倾向性的二级结构的序列基序。 3.物理稳定性
另外一个设计关注是多肽ELBL薄膜的稳定性的控制。离子键、 氢键、范德华相互作用和疏水性相互作用为ELBL薄膜提供了一些尽 管相对有限的稳定性。相反，共价的二硫键可以提供特殊的结构强 度。我们已经设计了使用半胱氨酸(或一些其他类型的含巯基氨基 酸)来\"锁定\"和\"解锁\"相邻的ELBL薄膜多肽层的新型方法。该方法 使多肽纳米加工的薄膜能够在极端PH下保持稳定，产生对其机械稳 定性和扩散性质的较强控制(关于由非多肽聚电解质制成的多层薄 膜的多孔性的讨论，参见Caruso, F. ， Niikura， K. ， Furlong, N. 和Okahata (1997) L3塔廳\'rl3:3427以及Caruso, F. ， Furlong, K Ariga， K. , Ichinose， L禾口Kunitake, T. (1998)力3/7g丽\'r 14:4559, 两者在这里都通过引用整体并入本文)。而且，在所设计的多肽的序 列基序中整合入半胱氨酸(或一些其他类型的含巯基氨基酸)实现 了相对短的肽在薄膜制造中的使用，由于分子间二硫键的形成。没
有半胱氨酸，这种肽一般不能生成足够稳定的薄膜(见图12，如下讨 论)。因此，我们新颖的半胱氨酸的使用将避免需要在大部分可能 的应用中生成昂贵的长类型的设计的多肽。这将特别有利于要在被 包裹的材料上制造薄膜的情况，所述材料如小的药物晶体、小球状 的血红蛋白晶体或含有血红蛋白的溶液。
对于其中薄膜物理稳定性是重要的应用，含有半胱氨酸(或一些 其他类型的含巯基氨基酸)的氨基酸序列基序可以选自使用上述方 法识别的基序文库，或者使用上述原理进行重新设计。然后，能够 根据所选自或设计的氨基酸序列基序设计并形成多肽。 一旦多肽被 化学合成或在宿主生物体中生成，则在还原剂存在完成含有半胱氨
酸的肽的ELBL组装，以防止过早的二硫键形成。紧接着组装，还原 剂被去除并加入氧化剂。在氧化剂存在下，半胱氨酸残基之间形成 二硫键，从而一起\"锁定\"含有它们的多肽层。
该\"锁定\"方法可以使用下面的特定的微囊制造的例子来进一步 描述。首先，含有半胱氨酸的设计的多肽被用来在适当荷电的球形 表面上通过ELBL制造多层，正常在中性pH下并含有二硫苏糖醇 (〃DTT\")(—种还原剂)的水溶液中。接下来，通过过滤、渗滤或其 他现有技术中已知的类似方法去除DTT，引起胱氨酸形成配对的半胱 氨酸侧链并从而稳定薄膜。如果肽多层被构建在含有希望包裹的物 质(例如晶状体物质)的核心颗粒上，所述制造过程是完全的并且 能够随后使所述核心颗粒在被包裹的环境中溶解，例如通过pH的改 变。然而，如果所述多层被构建在\"对照剂\"核心颗粒上，则所述核 心必须被去除。当例如三聚氰胺甲醛颗粒(〃MF〃)时， 一般通过降低 pH溶解核心一溶解是酸催化的。随着核心的溶解，溶液的pH被调至 4其中肽多聚阴离子上的部分电荷使微囊可半渗透的(compare Lvov 等人(2001) 7V朋0 Ze\"ers 1: 125，其由此整体并入本文)。接下 来，lOmM的DTT被加至微囊溶液以减少胱氨酸至半胱氨酸。然后微 囊可以被\"装填\"，通过将它们转移至将要被包裹的材料的浓缩溶 液，例如，蛋白质(ibid)。所述蛋白质通过移下其浓度梯度而进入,
微囊。微囊化的蛋白质通过去除还原剂和加入氧化剂而被\"锁入\"， 从而促进二硫键的形成。
本发明的半胱氨酸\"锁定\"和\"解锁\"的方法示意图在图4中显示。 半胱氨酸能够同时形成分子内和分子间的二硫键。进一步的，二硫 键能够在同一层或相邻层中的分子间形成，取决于薄膜中含有半胱
氨酸的肽的位置。参考图4 (a)，碱性多肽2通过二硫键3在其中 碱性肽含有半胱氨酸的所有层中连接。插入层(图中由半透明层4 表示)的酸性肽不含半胱氨酸。然而，如果酸性和碱性侧链在周围 环境的pH下荷电，则交替层继续静电相互吸引。参考图4(b)， 二硫 键在层间显示。这种结构将在用于ELBL的酸性和碱性多肽(即交替 层)同时含有半胱氨酸并且所使用的方法己经适合于二硫键形成的 时候形成。参考图4(c)，还原和氧化反应通过分别断裂和形成二硫 键3被用来调节被包裹的化合物5的释放，并从而调节颗粒通过囊 壁的扩散。
半胱氨酸\"锁定\"和\"解锁\"是调节ELBL薄膜结构完整性和渗透性 的新颖方法。现有技术已知戊二醛能够被用来交联蛋白质，这种化 学物质因此能够被用来稳定多肽薄膜。然而，戊二醛交联是不可逆 的。相反，本发明的半胱氨酸\"锁定\"和\"解锁\"方法是可逆的并因此提 供了对结构形成更好的控制，并且重要的是提供了能够使用本发明 方法制造的薄膜和胶囊的应用。血液是一种氧化环境。因此，在某 一生物医学应用中，例如由设计的多肽所制造的人工红细胞或给药 系统，在二硫键形成后将Cys-交联的多肽薄膜暴露于血液或一些其 他氧化环境不预期引起这些键的断裂。最后，还应该注意，涉及非 天然氨基酸的应用将使用一些其他的含巯基氨基酸类型取代Cys。例 如巯基能够被加至P-氨基酸如D，L-(3-氨基-(3-环己基丙酸D,L-3-氨基丁酸；或5-(甲基硫)-3-氨基戊炔酸(见 http://www. synthatex. com)。
4.生物相容性
生物相容性是生物医学应用中的主要设计关注。在这类应用中， 本发明的实施者将旨在识别会产生\"免疫惰性\"多肽的基因组或蛋白
组信息，特别是如果形成或包裹的对象将与循环血液接触。为了本 发明的目的，优选地，上述(A)(1)部分中讨论的选自过程被用来分 析血液蛋白的氨基酸序列。这将使最小化生物体免疫反应的机率最 大化。
存在用于预测氨基酸序列抗原性的计算机算法。然而，这类方法
在现有技术中已知为至多是半可靠的。在本发明中，使用上面(A) (1)
部分中讨论的选择方法所识别的序列基序是高极性的。因此，所述 基序必须出现在天然状态蛋白质的表面，其中基序是所述蛋白质的 部分。\"表面\"是折叠蛋白质与溶剂相接触的部分或因为水的粒状性 质而难以独自接近溶剂的部分。\"内部\"是折叠蛋白质因任何其他原 因而难以接近溶剂的部分。折叠的球状可溶性蛋白类似有机晶体， 内部被稠密地包裹如在晶格中而外部与溶剂水相接触。因为它们的 电荷性质，使用本发明方法识别的多肽序列基序必须主要(如果不 是唯一地)发生在蛋白质表面上。因此，当所述蛋白质在血液中时， 使用本发明的选择方法在人类血液蛋白中识别的所有序列基序总是 与免疫系统有效地接触。这适用于可以在血液中数目增加的蛋白质 的所有构型，包括变性状态，因为这高度积极不利于传递电荷从水 介质至低价电解质(如存在于蛋白质内部)。因此，被接受的生化 原理表明，使用本发明方法从血液蛋白设计的多肽或者不会引发免 疫应答或者引发最低限度的免疫应答。同样的原因，使用本发明方 法设计的多肽应该是可生物相容的。不仅是血液蛋白中的那些，使 用本发明的选择方法从基因组数据中识别的所有序列基序都应该是 可生物相容的，尽管免疫应答或任何其他类型的生物反应的程度很 可能依赖于序列基序的特定细节(因为基序所基于的多肽序列实际 存在于所述薄膜为之制造的生物体中，这种方法将至少原则上同样 适合用于任何类型的生物体。例如，该方法可以对兽医科学具有重 要价值)。免疫反应和生物相容性对设计的肽在生物医学应用中的 用途都是重要的，包括但不限于生产人工红细胞、给药系统或用于 制造生物相容性薄膜以包裹用于长期或短期引入生物体的植入物的 多肽。
5.生物活性
在多肽薄膜、涂层或微囊的一些应用中，期望调整多肽的设计来 包括用于某一结构层(通常是最外层)的功能性结构域。这里的功 能性结构域是具有特定生物功能性(例如结合磷酸酪氨酸)的蛋白 质的独立地热稳定区域。现有技术中已知这种生物功能性可以与多 结构域蛋白质中的其他功能性整合，例如在张力蛋白中，其包括磷 酸酪氨酸结合结构域和蛋白质酪氨酸磷酸酶结构域。在设计的多肽 中包括这种结构域可以许多方式行使功能，包括但不限于特异性配 体结合、细胞内靶向、生物传感或生物催化。
在一个实施方案中，多层膜包含第一层复合多肽，所述第一层复 合多肽包含与一个或多个功能区连接的一个或多个表面吸附区，其 中所述第一层复合多肽和所述一个或多个表面吸附区具有相同极 性。所述表面吸附区包含一个或多个氨基酸序列基序。所述第一层
复合多肽长度至少为15个氨基酸，并且在pH 4至10的水溶液中具 有大于50 ng/mL的溶解度。在一个实施方案中， 一个或多个表面吸 附区和一个或多个功能区具有相同极性。在另一实施方案中，所述 第一层复合多肽在pH 4至10时的溶解度大于或等于约1 mg/mL。溶 解度是实际的限制，以促进多肽从水溶液沉积。复合多肽聚合度的 实际上限为约l，OOO个残基。但是，可以想象，更长的复合多肽可 以通过适当的合成方法来实现。
在一个实施方案中，复合多肽包含一个功能区和一个表面吸附 区，其中所述表面吸附区包含两个氨基酸序列基序。在另一实施方 案中，复合多肽(4)包含一个功能区(3)和两个表面吸附区(1，2)， 一 个吸附区连接至功能区的N末端，而另一吸附区连接至功能区的C 末端，其中每个表面吸附区包含一个或多个氨基酸基序，并且两个 表面吸附区相同或不同并具有相同的极性(图13)。表面吸附区的目 的是使多肽能够吸附在带相反电荷的表面上，以构建多层膜。功能 区的目的是为所述膜提供特定功能性，例如生物功能。其他类型的 功能是可能的。例如，在一个实施方案中，功能区赋予多肽多层以 高度特异性结合二价钙离子的能力，因为在此情况下，功能区是已 知的钙结合蛋白质基序，例如人乳蛋白(x-乳白蛋白的钙结合环。即 使一些生物大分子表现出这种能力，并且实现这种结合的肽结构己 经被设计成多层膜，但是多层膜高特异性结合钙离子的能力决不是 生物的。
相对功能区的数目和/或长度的复合多肽中表面吸附区数目与溶 解度需求有关。例如，如果功能区是短的氨基酸序列，例如\"RGD\"，
即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，则仅需要一个至少12个氨基酸残基的
氨基酸序列基序来吸附复合多肽至适当荷电表面上。相对比，如果
功能区是适当折叠的蛋白质结构域，例如包含120个氨基酸残基， 则通常两个氨基酸序列基序将足以赋予复合多肽足够的电荷以使其 为水溶性的并适合吸附。所述基序可以是连续的并位于结构域的N 末端，或者是连续的并位于结构域的C末端，或者是不连续的，一 个位于N末端而一个位于C末端。
与复合肽功能区的氨基酸残基数目相比较结合的表面吸附区长 度与由于热能的分散更有关，所述分散必须在复合肽吸附的同时被 克服。因此，将功能区聚合度提高至两倍不一定需要表面吸附区长 至复合肽表面吸附区有效结合长度的两倍。复合肽与表面的吸附的 物理基础是静电吸引(和抗衡离子释放至总体溶液)，结构域的精 确质量对于纳米长度尺度是次重要的，抵抗复合肽吸附的主要 \"力\"是热能，鉴于此，本领域技术人员能够容易设计适合物理吸 附至特定目标功能区表面的表面吸附区。
一个功能区包含3至约250个氨基酸残基术语功能区包括功能 基序和功能结构域。功能基序包括相对少的氨基酸残基，因此一般 不具有紧密或持久的三维结构;但是，它们可以表现出特定功能性， 如一些肽激素和神经肽的功能，并且它们可以包含二级结构元件例 如or螺旋和(3-折叠。功能基序的实例由细胞外基质蛋白纤维结合素 的RGD序列提供。当功能单元是功能基序时，其通常包含3至约50 个氨基酸残基。当功能区是结构域时，其通常包含约50至约250个 氨基酸残基。
功能区在本文定义为至少多肽的一部分，当折叠时产生其自身的 疏水核心。例如，天然蛋白可以含有多个结构域，每个结构域作为 独立的结构和功能单元起作用。 一个结构域的生物功能可以完全独 立于另一个结构域的功能，如同一肽链中的催化结构域和结合结构 域的情况，其中这两个结构域彼此完全不相互作用。天然蛋白中结 构域之间的结构相互作用不仅是可能的，而且是相对普遍的；在这
些情况下， 一个结构域与另一结构域之间的相互作用可以视为一种 四级结构。
本文使用的功能结构域通常具有最少约50个氨基酸残基和最大 约250个氨基酸残基。原则上，蛋白质的任何功能结构域可以用于 本文描述的复合肽，只要复合多肽具有用于ELBL沉积的适当水溶解 度。在一个实施方案中，功能结构域在pH 4至10具有大于50昭/mL 的水溶解度。在另一实施方案中，功能结构域在pH 4至10具有大 于1 mg/mL的水溶解度。在另一实施方案中，当功能单元包含功能 结构域时，第一层复合多肽包含至少两个氨基酸序列基序。
当复合多肽包含替代功能结构域的功能基序时，其每个残基的净 电荷通常大于或等于0. 4。但是，如果功能基序具有小于0.4的净电 荷/残基，则一个或多个表面吸附区的每个残疾通常会具有大于0.4 的净电荷，以补偿并给予复合多肽适当的电荷性质，用于溶解性和 物理吸附。
包括在复合多肽中的适当功能区包括控制薄膜稳定性和/或封 囊物质从薄膜/胶囊释放的含半胱氨酸的基序或蛋白酶识别部位；控 制免疫原性的T细胞表位、B细胞表位或细胞毒性T淋巴细胞表位； 适合通过酶催化连接单糖或多糖的序列，例如，如在N-联或O-联糖 基化中；控制表面功能性和组织工程的细胞外基质蛋白中的肽识别 序列；控制抗微生物性质的抗细菌肽的序列；用于体内特异性耙向 跨膜受体的细胞外结构域；和用于控制二价阳离子结合的阳离子结 合基序，例如EF手基序。
在一个非限制性实施方案中，复合肽的功能区包含蛋白酶识别序 列。适当的蛋白酶识别序列包括例如Xa因子识别序列He-Glu/
Asp-Gly-Arg I ，肠激酶识别序列Asp-Asp- Asp-Asp-Lys I ，凝血酶 识别序列Leu-Val- Pro-Arg I Gly-Ser ， TEV蛋白酶识别序列 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln i Gly， PreScissionTM蛋白酶识别序列 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln I Gly-Pro等。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区包含T细胞表位、 B细胞表位或细胞毒性T细胞表位。本文使用的\"T细胞表位\"指由 T细胞识别的任何肽抗原决定子。本文使用的\"B细胞表位\"指由B 细胞免疫球蛋白受体识别并且当施用至动物时能够在T细胞适当辅 助下引发抗体生成的任何肽抗原决定子。本文使用的\"细胞毒性T 淋巴细胞表位\"指由细胞毒性T淋巴细胞识别的任何肽抗原决定 子。所述表位是由病毒、细菌、真菌或寄生虫产生的多肽。有时， 所述表位可以是连接或能够连接单糖或寡糖的多肽，例如通过N-联 或O-联糖基化。
糖基化是在大部分真核细胞中发生的普遍且高度多样的蛋白质 修饰反应。这种修饰可以分为两大类，N-联和O-联。在N-联中，碳 水化合物部分连接至天冬酰胺侧链的酰胺氮，此时天冬酰胺是共有 序列Asn-X-Ser/Thr的部分。该信号对于糖基化是必要但非充分的， 例如，X不能是Pra并且当Pro刚好在Ser/Thr糖基化下游出现时， 糖基化被抑制，在0-联糖基化中，碳水化合物部分连接至Ser或Thr 的羟基氧；其还可以发生为酪氨酸的初步修饰和5-羟赖氨酸和4-羟 脯氨酸的次生修饰。在O-联糖基化位点周围高频率出现Pro、 Ser、 Thr和Ala残基。
线性表位是由沿聚合物链的氨基酸残基连续串构成的片断。通常 的线性表位长度约5至约30个氨基酸。相反，构象表位由两个或更
多个不连续的片断构成，所述不连续的片断通过抗原折叠成其天然 结构而结合在一起。构象表位一般对应的肽链比线性表位对应的肽 链更长。任一类型的表位都可以用作LBL的复合多肽的功能区。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区包含来自抗细菌肽 的序列。抗微生物肽包括例如延缓微生物生长的抑制性肽、有效杀 伤微生物的微生物肽(例如，杀菌和杀狂犬病毒的肽药物、杀菌剂
和消毒剂)以及有效干扰微生物繁殖、宿主毒性等的肽。抗微生物
肽的实例包括尼生素、杆菌素(carnobacteriocins) B2和BM1、明 串珠菌素(leucocin) A、肠膜菌素Y105、 sakacins P和A以及 curvacin A。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区是用于细胞外基质 (ECM)识别的肽识别序列。 一个这样的序列，RGD，出现在各种细 胞外基质蛋白中，并且是整联蛋白跨膜受体分子的关键识别序列。 另一ECM识别序列是GFOGER、 GLOGER或GASGER，其中\'O\'代表羟脯
氨酸。这些是用于胶原结合整联蛋白的胶原中的识别序列。两种识 别序列都适合用于LBL的复合肽的功能区。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区是信号传导基序， 由用于体内特异性靶向的细胞表面受体识别。受体的细胞外区域将 结合具有显著特异性的肽或蛋白质信号配体。肽或蛋白质配体可以 是肽激素(例如，胰岛素、加压素、催产素)、生长因子(例如VEGF， PDGF， FGF)等。这种信号序列适合用于LBL的复合肽的功能区。在 这样的情况下，用于LBL的复合肽的功能区通常是功能基序。类似 地，膜受体的细胞外区域适合用于LBL的复合肽的功能区。这样的 情况下，用于LBL的复合肽的功能区通常是功能结构域。
在另一非限制性实施方案中，用于LBL的复合肽的功能区是用于 控制二价阳离子结合的阳离子结合基序，例如EF手基序。其他阳离 子结合结构域包括C2结构i恭\"VSFASSQQ\"基序和dockerin结构域。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区是磷酸酪氨酸识别 结构域，例如蛋白酪氨酸磷酸酶结构域、C2结构域、SH2结构域或 酪氨酸磷酸酶结合结构域。来自多种不同蛋白质的该结构域对于独 立折叠单元是已知的。
在另一非限制性实施方案中，功能结构域是聚脯氨酸识别结构 域，例如SH3结构域。
复合多肽的每个独立区域(即，功能区和表面吸附区)可以通过 溶液相合成、固相合成或适当宿主有机体的基因工程来单独合成。 溶液相合成是用于生产目前市场上批准的大部分肽药物的方法。N
末端表面吸附区(l)、 C末端表面吸附区(2)和功能区(3)可以单独合 成(图14)。溶液相方法可以用来合成相对长的肽和甚至小的蛋白 质。通过溶液相方法制备的最长的肽是降钙素(32mers)。更普遍地， 该方法用来以多达数百千克的量制备小或中长度的肽。可以在遵循 良好生产规范的工厂里生长这么大量的所需肽。
或者，各个独立区域可以一起作为单个多肽通过溶液相合成、固 相合成或适当宿主有机体的基因工程而合成。任何具体情况下的方 法选择将依据方便或经济。
如果各个功能区和表面吸附区被单独合成则例如通过离子交换 色谱后高效液相色谱纯化后，它们通过肽键合成而结合。例如，N 末端表面吸附区(1)、功能基序(3)和C末端表面吸附区(3)可以单独 合成，然后结合生成复合多肽(3)(图15)。该方法类似于所谓的杂 交合成，其中带有完全保护侧链的肽片断通过固相技术合成，然后 通过溶液相或固相方法的肽键而结合。这种杂交方法已经用来合成 T20， 一种36个氨基酸残基的肽，但是它还没有被广泛利用。
图17描述了包含2个表面吸附区(120和130)和1个功能区(110) 的\"复合\"多肽的实施方案。120是N末端表面吸附区。130是C末 端吸附区。每个表面吸附区包含一个或多个基序。\"复合\"多肽是 表面吸附区和功能区在单个多肽链中的独特组合。连接体肽序列 (140)可以用来产生在单个多肽链中包含多个功能区的复合多肽。在 一个实施方案中，功能区110可以是包含约50至约130个氨基酸残 基的小功能区，并且具有约2nm的直径。在替代实施方案中，功能 区110可以是包含约250个氨基酸残基的大功能区并且具有约4nm 的直径。16个氨基酸残基在伸展构型时的长度为约5. 5 nm。
图18 (200和300)描述了与表面(150)连接的包含2个表面吸附 区(120禾Q 130)和1个功能区(lll， 112)的\"复合\"多肽的实施方 案。图18的实施方案200描述了与表面(150)连接的包含2个表面 吸附区(120和130)和1个功能区(1U)的\"复合\"多肽，其中功能 区1U代表包含约50至约130个氨基酸残基的小功能区，并且具有
约2 nm的直径。小功能区111可以是短肽序列，例如RGD。 120是N 末端表面吸附区。130是C末端吸附区。
图18 (300)进一步描述了包含2个表面吸附区(120和130)和1 个功能区(112)的\"复合\"多肽，其中功能区112代表包含约250个 氨基酸残基的大功能区，并且具有约4nm的直径。大功能结构域112 可以是蛋白质的结构域，例如张力蛋白的PTP结构域。120是N末端 表面吸附区。130是C末端吸附区。
构建复合肽的模拟方法的优点包括利用了之前所述的氨基酸序 列基序技术，使风险最小化。其他优点包括有关几乎任何可以想象 的功能区方法的共性；以及含有相同或不同功能区和相同或不同表 面吸附区的具有相同符号电荷的化学上不同的肽可以同时被吸附， 产生了所需要的单功能或多功能表面。作为单个构建块合成表面吸 附区和功能区的优点包括预制备和实际不确定地保存(通过冻干) 单个构建块，以准备待用；通过使用大量制备的保存的构建块低成 本生产特定功能性的复合肽；与直接固相、溶液相或生物合成相比 较，快速制备复合肽；因为模拟合成方法而对有关功能区的新发展 做出快速反应；以及使用基于完全合成的肽和多肽层材料作为最小 化微生物污染的方式，从而简化了美国食品药品监督管理局对产品 的审批。
C.使用本发明方法设计的多肽的用途
如上所述适当的设计的多肽是用于ELBL的优良材料使用ELBL 制造的多肽薄膜结构将有用于许多不同类型的应用。使用本发明方 法设计的多肽已经表明有用于薄膜结构的ELBL，用于在生物医学技 术、食品技术和环境技术中可能的应用。例如，这种多肽能够被用 来制造人工红细胞。
6.人工红细胞
许多不同的方法己经被用于红细胞替代物的开发。 一种方法涉及 全氟化碳的使用。全氟化碳乳剂包含能够结合氧并传递它至组织的 合成的氟代烃。然而，该方法增加了网状内皮细胞阻断。全氟化碳 能够在网状内皮系统中被捕捉，其可以导致不利后果。
另外一种方法关注于抗原伪装，其涉及使用被称为聚乙二醇
(PEG)的生物相容性聚合物来包裹红细胞。PEG分子在所述细胞表
面形成永久的共价键，以便血液受体的抗体不将所述细胞识别为异
质的。例如，具有A型血液的正常人的免疫系统将天然地具有识别B 型红细胞表面抗原的抗体，导致细胞破坏。PEG与B型红细胞表面的 连接\"伪装\"了细胞的表面，以便它的表面抗原不能再被免疫系统识 别且抗原性的异质红细胞将不会被迅速摧毁(参见Pargaonkar， N.A. ， G. Sharma和K. K. Vistakula. (2001) \"Artificial Blood: Current Research R印ort〃，其由此通过引用被整体并入本文)。
包括珠蛋白生成障碍性贫血在内的需要重复的血液输入的许多 疾病常常并发于针对\"较小\"红细胞抗原的抗体的发風该\"同种致敏\" 能够致使这些患者几乎不可能输血，致使威胁生命的境地。在体外 测试中，PEG修饰的红细胞表现出不触发同种致敏并还可能有用于同 种致敏已经发生的临床表现(见Scott， M.D.等人(1997) \"Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes, 〃尸roc 7fe〃. ^cad 5bZ USA. 94 (14) : 7566—7571， 其由此通过引用整体并入本文)。
其他方法涉及纯化的血红蛋白。未经修饰的无细胞的血红蛋白具 有已知的局限性。这些包括对于有效的组织氧合作用而言过高的氧 亲和力、对于临床有效而言过短的血管内腔中的半衰期和经历结果 为肾脏管状损伤和毒性的分解成二聚体的趋势。因为这些局限性， 被用来制备无细胞的红细胞替代物的血红蛋白必须被修饰。许多修 饰技术已经被开发。血红蛋白能够使用如戊二醛的试剂被交联(通 过化学修饰形成两个分子间的共价键)并聚合。这种修饰导致P5。(所 有氧合位点的50%被占有时的氧分压)比正常血红蛋白高的产物并增 加血浆半衰期至30小时。用于此目的的血红蛋白的来源可以是人类 (过时的捐赠血液)、牛或人类重组体。经修饰的血红蛋白的溶液 从高度纯化的血红蛋白制备并通过各种生化过程提取以清除磷脂、 内毒素和病毒污染物(见Nester， T.和Simpson, M (2000) 〃Transfusion medicine update, 〃 WJoc^ 6^Z s^z.tt/z^51， 其由]t匕通过引用整体并入本文)。Biopure公司(Cambridge, MA)己经使用修饰 的血红蛋白用于他们的产品Hemopure。
修饰的血红蛋白溶液的主要的潜在不良作用是全身和肺循环血 管阻力的增加，其可以导致心脏指数的降低。心脏指数的降低可以 损害最佳的氧传递并超过氧运送溶液的优点(见Kasper S. M.等人. (1998) 〃The effects of increased doses of bovine hemoglobin on hemodynamics and oxygen transport in patients undergoing preoperative hemodilution for elective abdominal aortic surgery, 〃 細化87: 284-91 ，其由此通过引用整体并
入本文)。 一项研究已经检验了这些溶液在不稳定床上患者的急性复 苏相中的效用。然而，研究的设计是差的，且溶液在影响最终患者 结果中的任何作用是不清楚的(见Koenigsberg D.等人.(1999) \"The efficacy trial of diaspirin cross-linked hemoglobin in the treatment of severe traumatic hemorrhagic shock, 〃 Jcsd ^77e2^. #ed 6: 379-80，其由此通过引用整体并入本文)。
无细胞的血红蛋白的许多问题可以通过使用人工膜包裹它而被 克服。脂质体正在被用来包裹作为血液替代物而使用的血红蛋白。 该方法在技术上是具挑战性的，因为不仅必须血红蛋白被制备，而 且它必须以相对高的浓度和收率被包裹。最终产物必须是无菌的并 且脂质体必须在尺寸上相对均一。
包裹的血红蛋白比无细胞的血红蛋白具有几个优点。首先，人工 细胞膜保护血红蛋白免受血浆中的降解和氧化力。第二，所述膜保 护脉管内皮免受血红蛋白的毒性作用。这些作用涉及亚铁血红素的 丢失、02游离基的生成和恥结合的血管收缩作用。第三，包裹大大 增加了血红蛋白的循环持续性。而且，包裹的血红蛋白能够被冷冻 千燥用于方便储存。
脂质体包裹涉及磷脂，如在细胞膜中的磷脂。然而与脂质体包裹 相关的一个主要问题是很难调节脂质体的平均尺寸和分布。另一个 问题是不像红细胞，脂质体通常是非常不稳定的，由于他们通常缺 乏有组织的细胞骨架。而另外一个问题是脂质体通常由磷脂的多层
组成(近期关于血液替代物发展的综述出现于Stowell等人(2001) Progress in the development of RBC substitutes, 7hm9/l/57\'o/ 41:287-299，其由此通过引用整体并入本文。还参见Chang, T. 1998 \"Modified hemoglobin- based blood substitutes: cross linked, recombinant and encapsulated hemoglobin\" ， Arti/!z\'\"\'a2 /J 5Y//^2 2:233-41,其由此通过引用整体并入本文)。
采用了使用本发明方法设计的多肽的红细胞替代物相对于现有 技术中已知的红细胞替代物开发方法应提供几个优点，包括但不限 于优良的氧和二氧化碳结合功能性、较低的生产成本(大规模并因 此低成本的生产是可能的，因为细菌可以被用来大量生产肽并因为 肽ELBL能够被自动化)、使用适当的血红蛋白制备方法作为ELBL 模板的可能性、多肽的生物可降解性、基于血液蛋白结构的设计的 多肽的免疫\"惰性\"和设计的多肽薄膜所展现的超越脂质体的结构稳 定性。多肽ELBL组装生成了半多孔薄膜，最小化了形成包裹方法和 使葡萄糖、氧、二氧化碳和各种代谢产物能够通过作为脂双层的薄 膜自由扩散所需的材料量。相反，可能适合此目的的其他聚合物具 有不想要的不良作用一例如，多乳酸化合物降解成乳酸、导致肌肉 痛性痉挛的物质和聚(苯乙烯磺酸)不是生物相容性的。
微囊可以由设计的多肽制造以包括血红蛋白来作为红细胞替代 物。血红蛋白多肽微囊还可以被设计以包括酶，包括通常对红细胞 功能是重要的超氧化物岐化酶、催化酶和高铁血红蛋白还原酶。而 且，纳米加工的微囊可以被预测性地脱水，表明如这里描述制成的 人工红细胞可以被脱水而无功能损失，特别因为血红蛋白可以被低 压冻干(即冷冻干燥)并被重新溶解而无功能损失，且聚离子薄膜 对于脱水作用是稳定的。这对长期储存、血液替代物运输、战场应 用(特别是在远的地方)和空间探索是重要的。
使用本发明方法设计的多肽还能用于药物传输。
7.药物传输
\"晶体\"形式的适当的治疗性物质的微米大小的\"核心\"可以被设 计的多肽包裹，生成的微囊可以用于药物传输。所述核心必须在某
些条件下(例如高PH或低温)是不溶的并在某些条件下(其中将出 现控制释放)是可溶的。晶体上的表面电荷可以通过；电势测量(用 于测定液体介质中胶体颗粒上静电单元中的电荷)来测定。微囊内 含物从微囊内部释放至外周环境的速率将取决于许多因素，包括包 裹外壳的厚度、外壳中使用的多肽、二硫键的存在、肽的交联程度、 温度、离子强度和用来组装肽的方法。通常，胶囊越厚，释放时间 越长一原理类似于凝胶过滤色谱。
己经做了一些关于从ELBL微囊缓释释放的工作(见Antipov， A.， Sukhorukov， G, B. ， Donath， E.和Miihwald， H. (2001) /C/ e瓜 B， 105:2281—2284和Freemantle, M. (2002) Polyelectrolyte multilayers, C力e瓜Ay^. 7\\fe^， 80: 44-48，两者在这里通过引用 整体并入本文)。已经被使用的聚电解质是PSS、 PAH、 PAA、 PVS、 PEI 和PDM。
使用本发明方法设计的多肽应该提供许多有关药物传输方面的 优点，包括但不限于对微囊的物理、化学和生物学特征的控制； 制备直径小于lmm的胶囊的能力，使胶囊适合于注射；引发免疫应 答的低的可能性；胶囊的普遍高的生物相容性；如下所述通过改变 所述层的厚度和使用半胱氨酸对微囊扩散性质的控制；通过使用半 胱氨酸(如现有技术中已知的，游离巯基基团、游离氨基基团和游 离羧基基团是用于特异性靶向的分子可以被连接的位点)中高反应 性的巯基基团修饰微囊表面或者通过在多肽设计中包括特异功能性 结构域来耙向特定位点的能力；和微囊被细胞利用内吞或胞饮而吸 收的能力。
使用本发明方法设计的多肽还能用于抗微生物涂层。 8.抗微生物涂层
本发明的方法能够用来生产包括抗微生物肽的薄膜。例如， 一种 适当的序列可以是存在于人类中的富组蛋白5:
Asp Ser His:Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr (SEQ ID NO: 8)。
在弱碱性pH下的正电荷优势使该序列非常适合于ELBL。它可以 附加至使用本发明方法设计的肽，产生适合于在ELBL中使用的抗微 生物肽。该肽能够被用作抗生物污垢涂层。例如，所述肽能够被用 来在用于植入的装置上形成涂层。
使用本发明方法设计的多肽还能在许多其他领域应用。
9.其他用途
关于使用本发明方法设计的肽的其他可能的用途包括但不限于 食品盖、包装和分离层；食品箱、包、袋和标签；食品涂层；食品 成分微囊；药物涂层、胶囊和微囊； 一次性食品供给商品(盘子、 杯子、刀叉餐具)；垃圾袋；用于肥料和杀虫剂的水溶性袋；用于 肥料和杀虫剂的微囊；农业覆盖物；纸涂层；释放-充填包装； 一次 性医疗产品难(如手套和大衣)；和一次性尿布。
B.制造
一旦氨基酸序列基序已经从使用上面(A) (1)部分讨论的方法所 识别的序列基序被选择或者被重新设计，则使用现有技术中已知的 方法合成所设计的多肽，如使用固相合成和F-moc化学或异源表达 基因克隆和转化。设计的多肽可以由肽合成公司(例如SynP印公司 (Dublin, California))合成，或者使用肽合成仪在实验室生成， 或者通过重组方法生成。
在一个实施方案中，设计的多肽(例如，第一层多肽)包含多个 随机结合生成一个多肽链的单个氨基酸序列基序。在设计用于ELBL 的多肽中，同样的基序可以被重复，或者不同的基序可以被连接。 而且，如上所述，可以包括功能性结构域。氨基酸例如甘氨酸或脯 基酸可以被用来连接序列基序，以便保持多肽的整体电荷性质，艮P， 多肽上每个残基的净电荷强度为0.4。在一个实施方案中，连接体包 含l-4个氨基酸残基，例如卜4甘氨酸或脯氨酸残基。另外，不同 于20种普通氨基酸的氨基酸可以被包括在基序本身中，取决于多肽 所需要的性质。使用现有技术中已知的方法，其他性质同样可以由 设计要求所指定。例如，脯氨酸可以被包括用于转角形成，甘氨酸 用于链灵活性，和组氨酸用于在接近中性pH下的pH敏感的电荷性
质。\"疏水性的\"氨基酸也可以被包括一疏水性残基内含物能够在组 装行为中起作用并通过类似球形蛋白的疏水稳定化的方式促进层的 稳定性。
在一个实施方案中，第一层多肽包含一个或多个氨基酸序列基 序，其中所述多肽长度为至少15个氨基酸，并且在pH 7.0下，相 同符号荷电残基的数目减去相反符号的残基数目，与多肽总残基数
目的比值大于或等于0.4。换言之，多肽上每个残基的净电荷强度大 于或等于0.4。在另一实施方案中，在pH 7.0下，相同符号荷电残 基的数目减去相反符号的残基数目，与多肽总残基数目的比值大于 或等于0. 5。换言么多肽上每个残基的净电荷强度大于或等于0. 5。
在一个实施方案中，设计的多肽长度大于或等于15个氨基酸， 在其他实施方案中，设计的多肽长度大于18， 20， 25， 30， 32或35 个氨基酸。此原因是，每分子的熵损失对于短聚合物来说是如此在 热力学上不利的，以至于对荷相反电荷的表面的吸附被抑制，即使 多肽具有每单位长度1个电荷；长的聚电解质比短的吸附更好。这 在图12中有所描述。被用于长度依赖性研究的肽的平均分子量是 1500-3000 Da (聚L-谷氨酸， 〃小的〃)、3800 Da (聚L-赖氨酸，〃 小的〃)、17000 Da(聚L-谷氨酸， 〃中的〃)、48100 Da (聚L-赖氨酸， 〃中的〃)、50300 Da (聚L-谷氨酸， 〃大的〃)和222400 Da (聚L-赖 氨酸， 〃大的〃)。图12中显示的数据清楚表明ELBL依赖肽的长度。 Cys的加入使相对小的肽能够用于ELBL，因为巯基基团能够被用来 在多肽间形成二硫化物交联。
C.薄膜组装
制备设计多肽多层膜的方法包括在模板上沉积多层带相反电荷 的化学物质，其中至少一层包含设计的多肽。成功沉积的聚电解质 将具有相反的净电荷。在一个实施方案中，设计多肽(或其他聚电 解质)的沉积包括在下述pH下使基质暴露于包含设计多肽(或其他 聚电解质)的水溶液其具有适合于ELBL的净电荷。在其他实施方 案中，设计多肽或其他聚电解质在基质上的沉积通过相继喷雾带相
反电荷的多肽溶液而实现。在其他实施方案中，在基质上的沉积通 过同时喷雾带相反电荷的聚电解质溶液而实现。
在生成多层膜的ELBL方法中，相邻层的相反电荷与抗衡离子释 放至溶液后的熵增加， 一起提供了组装的驱动力。相对层中聚电解 质具有相同净线性电荷密度不是关键的，而只要相对层具有相反电
荷。标准的膜组装过程包括在聚离子为离子化的pH(即，pH4-10)
下生成聚离子水溶液，提供带有表面电荷的基质，和将基质交替浸 入带电聚电解质溶液。基质任选在交替层沉积之间被洗涤。 本领域普通技术人员容易确定适合沉积聚离子的聚离子浓度。示
例性浓度为0. 1至10 mg/mL。通常，产生的层厚度基本上与沉积过 程中处于上述范围内的聚离子溶液浓度无关。对于典型的非肽聚电 解质例如聚丙烯酸和聚(盐酸丙烯胺)，通常的层厚度为约3至约 5A，取决于溶液的离子强度。短聚电解质通常形成比长聚电解质更 薄的层。对于薄膜厚度，聚电解质薄膜厚度取决于湿度以及层数和 薄膜组成。例如，50 nm厚的PLL/PLGA薄膜在氮干燥后收缩至1. 6 nm，通常，可以形成1-2 nm至100 nm或更大厚度的薄膜，取决于 薄膜的水合状态和组装中采用的聚电解质分子量。
另外，形成稳定的聚电解质多层膜所需要的层数将取决于薄膜中 的聚电解质。对于仅含有低分子量多肽层的薄膜，薄膜通常具有4 个或更多个带相反电荷的多肽双层。对于含有高分子量聚电解质例 如聚丙烯酸和聚(盐酸丙烯胺)的薄膜，包含一个带相反电荷的聚 电解质双层的薄膜可以是稳定的。
D.实验
1.实例1 一基于人类血液蛋白序列的多肽的设计以及它们在 多肽薄膜制造中的应用
为此工作，使用上面(A) (l)部分中描述的方法选择氨基酸序列以 识别人类血液蛋白的一级结构中的序列基序补体C3 (gi|68766) 是阴离子序列基序的来源，而乳铁传递蛋白(gi 14505043)是阳性序 列基序的来源。如上所讨论的，血液蛋白序列被用来最小化涉及所 述多肽的装置(包括，例如人工红细胞)可能被引入其中的患者的免
疫应答。原则上，该方法应该可应用于任何具有免疫系统的生物体；
它不限于人类。多肽由SynP印公司(Dublin, California)合成。所 述多肽序列为
TyrGluGluAspGluCys Gin Asp Gly Glu Glu AspGlu Cys
GinAspGlyGluGluAsp Glu Cys Gin Asp Gly GluGlu Asp
GluCysGinAsp
(SEQ ID NO: 2)
TyrArgArgArgArgSer Val Gin Gly Arg Arg ArgArg Ser
ValGinGlyArgArgArg Arg Ser Val Gin Gly ArgArg Arg
ArgSerValGin
(SEQ ID NO: 1)
TyrGluGluAspGluCys Gin Asp Gly Glu Glu AspGlu Cys
GinAspGlyGluGluAsp Glu Cys Gin Asp Gly GluGlu Asp
GluCysGinAspGlyGlu Glu Asp Glu Cys Gin AspGly Glu
GluAspGluCysGinAsp
(SEQ ID NO: 4)
TyrArgArgArgArgSer Val Gin Gly Arg Arg ArgArg Ser
ValGinGlyArgArgArg Arg Ser Val Gin Gly ArgArg Arg
ArgSerValGinGlyArg Arg Arg Arg Ser Val GinGly Arg
ArgArgArgSerValGin
(SEQ ID NO: 3)
氨基酸残基由上述给定的三字母表示。 一个甘氮酸在各7残基基 序之间被引入以抑制二级结构的形成。甘氨酸被选择用于此目的， 因为它允许在双面角的结合中最大的可变性(见Ramachandran， G.N. 禾口 Saisekharan， V. (1968)， A/r.尸rotej77 23:283，其
通过引用整体并入本文)并具有低螺旋倾向性(0. 677)和低折叠倾向
性(0.766)。或者，根据计算的结构倾向性脯氨酸可以取代基序间的 甘氨酸。另外，单个酪氨酸被包括在每个肽的N末端用于通过浓度 测定，通过在280nm处的UV吸收。SEQ ID N0:2在pH 7时的净电荷 强度为20/32 (0. 625); SEQ ID N0:1的净电荷强度为16/32 (0. 5); SEQ IDN0:4在pH7时的净电荷强度为30/48 (0.625);而SEQ IDN0:3 在pH 7时的净电荷强度为24/48 (0.5)。在所有情况中，pH7时的
净电荷强度大于或等于约第一层多肽总长度的1/2。
多肽被分别命名为SN1(SEQ ID NO: 2)、 SP2 (SEQ ID NO: 1)、 LN3(SEQ ID NO: 4)和LP4 (SEQ ID NO: 3)，表示短阴性、短阳性、 长阴性和长阳性。这些序列非常不同于聚赖氨酸(一般在现有技术 中作为聚阳离子使用)和聚谷氨酸(一般在现有技术中作为聚阴离 子使用)，尽管其可商业获得且不昂贵，但其在温和PH的条件下具 有高度a-螺旋倾向性且重要的是免疫反应性的。在中性pH下，设计 的肽上计算的每单位长度的电荷对于SP和LP是0. 5静电单位以及 对于SN和LN是0. 6静电单位。阳性肽在某种程度上比阴性肽更具 疏水性，归因于缬氨酸和精氨酸侧链长烃的存在(如上所述，多肽 层间的疏水性相互作用能够稳定薄膜至一定程度)。所述长度与己 公开的研究一致，表明聚离子必须有大于20的荷电基团(即天冬氨 酸和谷氨酸；赖氨酸、精氨酸和组氨酸)以适合于ELBL(见K油anov， V.禾口Zezin， A. (1984)尸wr^4; p丄C/ e瓜56:343禾口 Kabanov， V. (1994)尸o^f瓜36: 143，两者在这里通过引用整体并入本文)。 a.实验说明 i.材料
镀银的QCM电极(USI-System, Japan)具有在每侧上的表面积 0.16 士 0.01 cm2、共振频率9 MHz (AT-cut)和长期稳定性土2 Hz。 通过电喷射质谱证实了多肽分子量。肽纯度大于70 %。多肽缓冲液 为10 mM磷酸钠或10 mM Tris-HC1， 1 mM DTT， 0. 1 mM叠氮化钠，pH 7.4。所有不同于多肽的化学物质均购自Sigma-Aldrich (USA)。
ii. 方法
使用成对的设计的多肽(一个阴性， 一个阳性)进行实验。使用
标准ELBL技术将由至少5个如上识别的SP2、 SN1、 LP4和LN3双层 所组成的多层薄膜沉积在QCM共振器上(双层由一层多聚阳离子和 一层多聚阴离子组成)。用于层吸附的多肽浓度是2 mg-mL—、已知 聚离子层的厚度对聚电解质浓度的依赖性不强(见Lvov, Y.和 Decher， G. (1994) Crj^^3^og 39:628，其在这里通过引用
整体并入本文)；在0.1-5 mg-mL—\'的浓度范围内，双层厚度近乎独 立于用于PSS/PAH的浓度。相反，多肽薄膜显得比那些使用高分子 量PSS/PAH(使用利用已知的Sauerbrey方程的A/数据计算的质量) 制造的薄膜厚度小很多；见Lvov, Y.和Decher，G. (1994) Cry\"aU^\". 39:628。这紧随根据沉积的质量计算薄膜厚度，
如在现有技术中通常对蛋白质所进行的。图3(c)中显示的为设计的 多肽组装所计算的厚度大于用于制造薄膜的肽的点对点长度。。DTT 以lmM被包括以抑制二硫键的形成。吸附时间为20分种。
在后续吸附循环之间共振器在纯水中被冲洗1分种(去除大约 10-15%的弱吸附物质)并在N2气流中干燥。然后，通过QCM直接测
量沉积肽的质量。质量测量包括一些水(尽管干燥)和低质量离子 如K+、 Na+和C1—。肽的相邻层的部分相互渗透是很可能的(见Decher， G. (1997) 6\"\".e騰227:1232; Schmitt等人(1993)船cr,JecWes 26:7058;和Korneev等人.(1995)尸力j^ \'ca万214:954);这对二硫 键\"锁定\"效率可能是重要的。
iii. 结果
在多肽吸附以及冲洗和干燥QCM共振器之后，测定共振器的共振 频率。这实现了在吸附上的频率转换和在吸附质量中的变化的计 算。频率的降低表明吸附质量的增加。结果在图3 (a)和3 (b)中被 提供。图3 (a)显示了在不同缓冲液(10mM磷酸钠，pH 7. 4， 1 mM DTT 和10 mM Tris-HC1, pH 7. 4， 1 mM DTT)中对LP4和LN3的吸附数据 的比较。根据这些数据，显然吸附数据更依赖于肽的性质而非使用 的缓冲液的特定性质。图3(b)显示了SP2、 SN1、 LP4和LN3的不同
组合(即SP2/SN1、 SP2/LN3、 LP4/SN1和LP4/LN3)在10mM磷酸钠(pH 7. 4和1 mM DTT)中的共振器频率与吸收层(线只连接实验数据点)。 如ELBL所要求的，这些组合的每一个都包括一个阳性多肽和一个阴 性多肽。图3(c)显示了 SN1和LP4在10 mM Tris-HCl (pH 7. 4和1 mM DTT)中计算的吸附质量与层数的图(使用Sauerbrey方程从实 验数据计算的)。总吸附质量(约5吗)大致相当于l mnol的肽。 用于此计算的方程是Am二一0.87，10—9A/，其中m是质量克，/是频 率Hz (见Lvov, Y. ， Ariga， K. ， Ichinose， L，和Kunitake, T. (1995) j瓜O e瓜5bc. 117:6117和Sauerbrey， G. (1959) Z尸A7幻A 155:206，两者在这里通过引用并入本文)。薄膜厚度d被估计为d = —0.016A/， 其中d是nm(见Yuri Lvov, \"Electrostatic Layer—by—Layer Assembly of Proteins and Polyions〃 in尸ro力ei/ Arc力itect\"re: i\"z ter/acj\'a2 /J/cJecwJar 爿5^e/aW7 朋c/ /腳Z^^\"。\"肠tec力/7c^o^j， (Y. Lvov H. Miihwald编辑，2000) (New York: Dekker， 2000) pp. 125-167，其通过引用并入本文)。 图3(c)中的线是对实验数据点的线性匹配。数据的线性是吸附过程
中精确规则的组装以及各吸附层中多肽大致均一密度的合适的指 标。吸附伴随一610 ± 60 Hz (阳离子)或一380 ± 40 Hz (阴离子)
的频移而发生。沉积多肽质量的线性增长表明组装过程中初期吸附 步骤的重复和多层制造过程的普遍成功。 iv.结论
以上结果显示使用本发明方法设计的多肽适合于ELBL，不管来 自PSS和PAH显著的定性差别，灵活的同聚物在pH 7. 4下每单位长 度具有1个电荷。聚L-赖氨酸和聚L-谷氨酸上每单位长度的电荷在 pH 7. 4下为1，如PSS和PAH具有的，但这些多肽在各种条件下都 具有显著的形成a-螺旋结果的倾向，使它们在需要对薄膜结构进行 控制时明显不适合于多层组装。然而，本发明的单分散的多肽使实 施者能够非常精确地知道正在被用于ELBL的材料的结构。而且，聚 L-赖氨酸、聚L-谷氨酸、PSS和PAH的普通商业制剂在人类中引起 免疫应答(即，是免疫原性的)。
因为如实验所证明的，设计的多肽容易被吸附在相反电荷的表面 之上，所以没有对\"前体\"层的需求。如现有技术已知的，\"前体\"层被 沉积在基质上以提高弱吸附性物质的吸附。前体层的缺乏提高了聚 离子薄膜的生物相容性(因为通常作为前体使用的聚合物是免疫原 性的)或允许比设计的多肽更低精确的对聚合物结构或薄膜结构的 控制。
设计的多肽的多层在人类血液pH (7.4)下是稳定的。因此，所 述多层应该有用于广泛的生物学应用。设计的多肽(每个多肽的每 个残基少于1个电荷)的吸附在2 mg/mL和低离子强度下基本在少 于10分种之内完成。这意味着这些多肽能够被用来快速并相对容易 地形成多层薄膜。在各层沉积之后使用N2 w干燥所述肽薄膜没有影 响组装。干燥的进行是为了得到准确的QCM频率测量，但不是组装 所需要的。
薄膜组装实验在比血液低的离子强度下完成但该过程产生与在 较高离子强度下性质上类似的结果。主要的差别每个吸附层沉积的 肽的量一离子强度越高，沉积的肽的量越大。这由图7中的图所描 述，其显示了沉积的物质的量作为离子强度的函数一所使用的肽是 聚L-谷氨酸和聚L-赖氨酸。QCM共振频率是针对吸附层标绘的。聚 L-谷氨酸的平均分子量是84600 Da，而聚L-赖氨酸的平均分子量是 84000 Da。用于组装的肽浓度是2 mg/mL。数据表明盐浓度(溶液的 离子强度)影响了薄膜组装。通常，每层沉积的物质的量随0-100mM NaCl范围内的离子强度而增加。由于在相对高的每单位长度净电荷 和低离子强度条件下使用设计的多肽的ELBL的基本特征似乎不依赖 于缓冲液的选择，在人类血液的离子强度下预期有在性质上的类似 结果。因此，缓冲液的选择应该不根本改变多层在其靶环境中的稳 定性。然而，即使缓冲的选择不影响多层的稳定性，\"锁定\"机制作 为稳定胶囊的设计特征将是可获得的。
阳性多肽比阴性多肽更大明显的沉积可以产生于阳性多肽在pH 7. 4下的每单位长度的较高电荷。沉积在每层中的物质很可能符合为
中和下面的表面的电荷所需要的物质。疏水相互作用也能够帮助解 释吸附行为的这一特征。
对于蛋白质和其他聚合物的普通薄膜厚度的计算很可能对于短
多肽(计算的厚度是60-90 rnii但10个多肽的累积长度约为120 nm) 是无效的。这很可能起因于相对短的多肽在吸附表面上的包裹的高 密度；该结果也符合薄膜厚度随离子强度变化的发现，由于聚合物 的结构性质将发生变化并且经由离子的电荷筛选将减少吸附肽之间 的层内电荷斥力。这里讨论的设计的多肽薄膜的厚度被估计为20-50 nm0
设计和制造循环的许多方面能够被自动化。例如， 一种计算机算 法可以被用来优化用于ELBL的肽的一级结构，通过比较预测的肽性 质和观察到的物理性质，包括溶液中结构、吸附行为和薄膜在极端 pH下的稳定性。而且， 一旦各个步骤的细节已经被基本确定，多肽 薄膜组装过程能够被机械化。
实例2—涉及含有半胱氨酸的重新设计的多肽的实验
b.多肽
使用的多肽为
Tyr Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys\'Gys Lys Gly Lys Val Lys
(SEQ ID NO: 5)
Tyr Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu
(SEQ ID NO: 6)
不同于在这里描述的实验中使用的其他多，jt这两个不是使用人
类基因组信息设计的多肽；它们被设计的唯一目的是评价在多肽薄 膜稳定化中二硫键形成的作用。SEQ ID N0:5的在pH7时的净电荷强 度为16/32 (0.5);而SEQ ID N0:6在pH7时的净电荷强度16/32 (0.5)。在这两种情况下，pH7时的净电荷强度大于或等于约第一层 多肽总长度的1/2。
c. 操作
所有实验在室温下进行。
所有使用QCM的组装实验在相同条件下进行，除了使用空气代替 氮气来干燥即将经历氧化的样品。组装条件是10mMTris-HCl， 10 mM DTT， pH 7.4。额定的肽浓度是2mg/ml。形成的层数是14。
用于氧化样品的二硫化物锁定条件是10 raM Tris-HC1， 1% DMSO， 使用空气饱和水，PH 7.5。\"锁定\"步骤持续6小时。用于还原样品 的条件是10 mM Tris-HCl， 1 mM DTT，使用氮气饱和水，pH 7.5。 该步骤持续6小时。
所有使用QCM的分解实验在相同条件下进行，除了使用空气代替 氮气干燥氧化样品。分解条件是10 mM KC1, pH2.0。在干燥前使用 D.I.水冲洗样品30秒钟。
三个不同类型的实验被进行(1)还原一无处理在组装后立即 进行分解(2)还原一6小时，如上所述用于还原样品；和(3)氧化一6 小时，如上所述用于氧化样品。
d. 结果
结果在图10中描述。在首先的两个实验(都是还原)中，所有 的沉积物质(100 %)在50分种内分解。相反，在氧化实验中，在肽 薄膜包被的QCM共振器在pH 2下保持5小时之后大量物质保留。多 肽薄膜在酸性pH下的稳定性由组装条件决定；这样，薄膜或胶囊的 稳定性是通过使用多肽作为ELBL的聚电解质而成为可能的设计特 征。
e. 结论
静电力在一起保持电荷相反的设计的多肽层中起关键作用。在酸 性pH下，在一个肽上的净电荷被中和且多肽薄膜由于静电排斥而分 解。还原条件防止二硫键的形成。因此，层间的静电吸引是在这些 条件下用于稳定层的唯一的结合力。相反，在氧化条件下，二硫键
形成。在酸性pH下，二硫键抑制薄膜分解。结果表明酸性pH下的
层稳定性直接受层内和/或层间的二硫键的形成一即同一层中的分
子间，相邻层的分子间，或两者一的影响。这通过图io中显示的结
果被描述一由于二硫化物锁定，超过30 %的薄膜在酸性pH下保持稳 定，不管在相对低的离子强度下的静电排斥。具有更多半胱氨酸残 基的肽被期望以进一步提高二硫化物锁定效率。而且，肽组装条件 的调节将是设计具有所需物理以及化学和生物学性质的薄膜的重要 方面。
实例3—涉及含有半胱氨酸的设计的多肽的实验 f.材料
该实验的基本要素是石英晶体微量平衡仪器；镀银的共振器(9 MHz共振频率)；阴性48-残基肽(LN3) (SEQ ID NO: 4);和下述序 列的称为\"SP5\"的阳性48-残基肽
Tyr Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His
(SEQ ID NO: 7)
像上面(D) (l)部分中讨论的其他设计的月fc使用上面(D) (l)中描 述的方法设计SP5以分析人类血液蛋白乳铁传递蛋白(gi I 4505043) 的氨基酸序列。ELBL缓冲液是10 mM Tris、 pH 7.4、 10 mM NaCl 和1 mM DTT。分解缓冲液是10 mM KCl、 pH 2。通过将4mg各肽加 入2mL上述缓冲溶液并调节各溶液至pH7. 4制备SP5和LN3的2mL 肽溶液；所述肽浓度为2 mg-ML一1。
g. 用于监测多肽层在QCM共振器上组装的操作 还原操作如下(1)在肽吸附之前检测并记录共振器的频率；(2)
共振器被浸泡入SP5肽溶液中持续20分种(3)共振器被浸泡入SP5 冲洗溶液中持续30秒钟；(4)共振器从冲洗溶液中移出并使用氮气 干燥；(5)记录共振器的QCM共振频率；(6)共振器被浸入LN3肽 溶液中持续20分种；(7)共振器被浸入LN3冲洗溶液中持续30秒 钟；(8)共振器1从冲洗溶液中移出并使用氮气干燥；(9)记录共 振器的QCM共振频率；(10)重复步骤2至9直至16层被吸附至共 振器上。
氧化操作与还原操作相同，除了共振器在D. I.水而非SP5缓冲 液或LN3缓冲液中冲洗，且在每次测量前使用空气代替氮气干燥。
h. 锁定操作
还原操作如下共振器被至于含有1 mM DTT的水溶液中持续6 小时。DTT， 一种还原剂，抑制了二硫键的形成。
氧化操作如下共振器被至于空气饱和的含有1 % DMSO的水溶 液中持续6小时。匿SO， 一种氧化剂，促进了二硫键的形成。
i. 共振器上的分解
i. 溶液
还原条件如下10 mM KC1， 1 mM DTT， pH 2。 氧化条件如下10 mM KC1， 20% DMSO， pH 2。
ii. 用于分解的操作
还原操作如下(1)通过QCM测定并记录共振器的初始共振频 率；(2)共振器被浸泡入还原分解溶液5分种；(3)共振器在还原 缓冲溶液中冲洗30秒钟；(4)共振器使用氮气干燥；(5)通过QCM 测定并记录共振器的共振频率；(6)重复步骤2至5用于在5、 10、 15、 20、 30、 60和90分种的时间读数。
氧化操作与还原操作相同除了共振器的冲洗在空气饱和的D. L 水而非还原缓冲液中进行。
丄结果
图8显示了在SP5和LN3的薄膜组装过程中沉积的大致线性的质 量增加。两个共振器都显示了在组装过程中几乎相同的质量沉积， 不论组装条件的差异。
图9显示薄膜组装过程中保留的材料的比例。经受氧化条件的层 在酸性pH下显示了最小的材料损失，有接近90-95%的质量保留。相 反，经受还原条件的层在暴露于酸性pH的前5分种之内损失了接近 全部的胞膜材料。
k.结论
结果表明，在酸性pH下，二硫键防止了层退化并保持层牢固地 在一起。在酸性pH下的层稳定性直接受层内和/或层间二硫键的形 成的影响。二硫键形成依赖于相互间半胱氨酸残基的浓度和亲近。 增加多肽每单位链长的浓度将因此直接影响二硫键的形成和薄膜稳 定性。增加用于薄膜组装的缓冲溶液的离子强度通过增加每吸附循 环的沉积物质的量和每层的厚度来影响薄膜中的半胱氨酸浓度。单 层中增加的半胱氨酸数目将以该方式增加形成的二硫键的数目并经 氧化增加薄膜稳定性。
实例4.包含RGD功能结构域的多肽薄膜，其中每个残基的线性 电荷密度强度约0.75。
在一个实施方案中，复合多肽的功能区是RGD序列，其中复合肽 的电荷密度约0. 75。 RGD序列结合受体蛋白整联蛋白的细胞外部分， 由此促进细胞粘附。样品肽设计如下
KKKAKKKGKKKAKKKGRGDKKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 8) EEEAEEEGEEEAEEEGRGDEEEAEEEGEEEAEEEY (SE0 ID NO: 9)
在该实例中，多肽SEQ ID NO: 8是带正电荷的多肽，具有RGD 功能区、第一表面吸附区KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 10)和第 二表面吸附区KKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 11)。该复合肽在pH7 下的净电荷强度/残基为+26/35或+0. 74。多肽SEQ ID NO: 9是带负
电荷的多肽，具有RGD功能区、第一表面吸附区EEEAEEEGEEEAEEEG (SEQ ID NO: 12)和第二表面吸附区EEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO: 13)。该复合肽在pH7下的净电荷强度/残基为—26/35或一O. 74。
已经合成了各种含有RGD序列的St并且研究了它们对多层膜组 装的适应性。还研究了多肽多层膜中包括RGD序列对不同哺乳动物 细胞连接和繁殖的影响。包含5个(阳性序列)和(阴性序列)双 层的多层膜沉积在石英板上。用于层吸附的复合多肽在PH7水溶液 中的浓度为2mg-ml/、吸附时间为20分钟。石英板在随后吸附循环 之间用纯水冲洗，以除去弱结合物质。在每层吸附之后，用于薄膜 组装的基质以N2气流干燥。然后，通过UV分光光度法测量沉积肽的 光学质量。图16比较了用于制备多层膜的肽中包括RGD对细胞繁殖 的影响。该技术可能用于为再生药物的长期目的的体外细胞和组织 培养。
实例5:包含RGD功能结构域的多肽薄膜，其中每个残基的线性 电荷密度强度约0. 4。
在一个实施方案中，复合多肽的功能区包含RGD序列，其中复合 肽的电荷密度约 0.4。样品肽设计如下
AAKAKAKGKAKAKAKGRGDKAKAKAKG薩AKAAY (SEQ ID NO: 14) AAEAEAEGEAEAEAKGRGDKAEAEAEGEAEAEAAY (SEQ ID NO: 15)
在该实例中，多肽SEQ ID NO: 14是带正电荷的多肽，具有RGD 功能区、第一表面吸附区AAKAKAKGKAKAKAKG (SEQ ID NO: 16)和第 二表面吸附区KAKAKAKGKAKAKAAY (SEQ ID NO: 17)。该复合肽在中 性pH下的净电荷强度/残基为+14/35或+0.4。多肽SEQ ID M): 15 是带负电荷的多肽，具有RGD功能区、第一表面吸附区AAEAE AEGE AEAEAEG (SEQ ID NO: 18)和第二表面吸附区EAEAEAEGE八EAEAAY (SEQ ID NO: 19)。该复合肽在pH7下的净电荷强度/残基为-14/35或-0. 4
要注意，复合肽的净电荷强度/残基可以通过改变表面吸附区和 功能区的结构来测定。在本实例中，前述实例的复合肽的净电荷通 过改变仅表面吸附区的结构来改变。原则上，可以使用相同的方法 来控制任何复合肽的净电荷强度/残基。但是，该方法中，表面吸附 区和功能区都应该独立适合使复合肽为可溶性的。
实例6:其中功能区包含两个功能结构域的复合肽，其中存在N 末端的表面吸附区和C末端的功能区。
在该实例中，功能结构域是Src同源区2(SH2)结构域(例如来 自人张力蛋白)和磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域(例如来自人张力蛋 白)。这些结构域结合在酪氨酸上磷酸化的特定蛋白。整合了人张 力蛋白指定结构域的复合肽的实例如下
KKXAKKXGKKXAKKKGKYWYKPEISREQAIALLKDQEPGAFIIRDSHSFRGAYGLA MKVSSPPPTIMQQNKKGDMTHELVRHFLIETGPRGVKLKGCPNEPNFGSLSALVYQH SIIPLALPCKLVIKYWYKPEISREQAIALLKDQEPGAFI工RDSHSFRGAYGLAMKVSSP PPTIMQQNKKGDMTHELVRHFLIETGPRGVKLKGCPNEPNFGSLSALVYQHSIIPLALP CKLVIKXKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO:20)
SEQ ID N0:10和SEQ ID NO: 11中的表面吸附区相同。SH2结构 域和PTB结构域序列可从National Center for Biotechnology Information访问NP—072174:
SH2 = KYWYKPEISR EQAIALLKDQ EPGAFIIRDS HSFRGAYGLA MKVSSPPPTI MQQNKKGDMT HELVRHFLIE TGPRGVKLKG CPNEPNFGSL SALVYQHS工工 PLALPCKLVI (SEQ ID NO: 21)
PTB = VLFVNSVDME SLTGPQAISK ATSETLAADP TPAATIVHFK VSAQGITLTD NQRKLFFRRH YPLNTVTFCD LDPQERK丽K TEGGAPAKLF GFVARKQGST TDNACHLFAE LDPNQPASAI VNFVSKVMLN AGQKR (SEQ ID NO:22)
我们已经合成了对应于人张力蛋白SH2结构域的基因和对应于 人张力蛋白PTB结构域的基因，并将所述基因克隆入细菌宿主，过 表达所述基因，纯化重组蛋白，表征所述结构域的各种物理性质。 在一个实施方案中，包含5个指定生物活性肽和聚(L-谷氨酸)双 层的多层膜沉积在硅晶片上用于表面鉴定，并沉积在石英板上用于 监测薄膜组装。用于层吸附的多肽在pH7水溶液中的浓度为2 mg-ML—\'。吸附时间为20分钟。基质在随后吸附循环之间用水冲洗1 分钟，以除去弱结合的物质。在每层吸附之后，基质用N2气流干燥。 然后，通过UV分光光度法测量石英上沉积的肽的光学质量，并通过 原子力显微镜检查法鉴定硅晶片上薄膜的表面形态。该技术可能用 于为再生药物的长期目的的体外细胞和组织培养。SH2结构域整合入 本文所定义的生物活性肽，能够使多层膜与磷酸酪氨酸肽结合。该 技术可能用于诊断目的。
实例7:在多肽N末端包含一个功能区和一个表面吸附区的复合 多肽
该实例中，功能区是已知的蛋白质功能结构域，例如人辅助蛋白 的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)结构域
KKKAKKKGKKKAKKKGLKDTLKDTSSRVIQSVTSYTKGDLDFTYVTSRITVMSFPLD NVDIGFRNQVDDIRSFLDSRHLDHYTVYNLSPKSYRTAKFHSRVSECSWPIRQAPSLH NLFAVCR丽Y丽LLQNPKNVCWHCLDGRAASSILVGAMFIFCNLYSTPGPAIRLL YAKRPGIGLSPSHRYLGYMCDLLA (SEQ ID NO:23)
表面吸附区与SEQ ID NO\'. 10相同。PTP结构域的序列可获自 National Center for Biotechnology Information, 访问号075061: PTP结构域
LKDTLKDTSSRVIQSVTSYTKGDLDFTYVTSRIIVMSFPLDNVDIGFRNQVDDIRSFLD SRHLDHYTVYNLSPKSYRTAKFHSRVSECSWPIRQAPSLHNLFAVCR應YNWLLQN
YMCDLLA (SEQ ID NO:24)
实例8:包含两个功能区的复合多肽，其中存在三个表面吸附 区， 一个在复合肽的N末端， 一个在C末端，还一个在两个功能区 之间，并且其中存在两个不同的糖基化功能区。
代表性的肽结构如下
SAR-功能区-SAR-功能区-SAR
其中，如前，SAR是基序并因此适合表面吸附例如RRRARRR (SEQ 工DN0:25)， 一个功能区含有N联糖基化的识别位点，例如GGNVSGG (SEQ ID N0:26)，另一功能区含有0联糖基化的识别位点，例如 PPSSSPP (SEQ TD N0:27)。
代表性复合肽的氨基酸序列为
RRRARRRGGNVSGGRRRARRRPPSSSPPRRRARRR (SEQ ID NO:28)
复合多肽在pH7时的净电荷强度/残基为+18/35^+0.5。这种情 况下的多层膜由指定的阳性肽和适当的阴性肽构成，例如
EEEAEEEGEEEAEEEGEEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO:29)
实例9:具有一个功能区的复合肽，其中复合肽C末端存在一个 表面吸附区，并且其中存在包含己知具有抗微生物活性的肽序列的 一个功能区。
代表性肽结构如下
功能区-SAR，其中如前，SAR是适当的表面吸附区，例如 KKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 11)，并且该功能区含有富组蛋白5 的序列，即，DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY(SEQ ID NO: 30)。代表性 复合肽的氨基酸序列为
RRRARRRGGNVSGGRRRARRRPPSSSPPRRRARRR (SEQ工D NO:31)
该代表性复合肽在pH 5.5时的净电荷强度/残基为+24/39 二 +0.6。该例中的多层膜由指定的阳性肽和适当的阴性肽构成，例如 SEQ ID NO:29。
实例10:具有一个功能区的复合肽，其中存在两个表面吸附区， 一个在功能区的N末端， 一个在C末端，并且其中功能区包含两个 特定蛋白酶识别位点和两个连接体每个连接体是单个甘氨酸残基。 在一个实施方案中，蛋白酶识别位点针对肠激酶和凝血酶-SAR-肠激酶识别-连接体-凝血酶识别-连接体-SAR 在每种情况下，SAR代表适当的表面吸附区，例如SEQ ID NO: 10 和SEQ ID NO: 11。例如，功能区被编码为DDDDKGLVPRGSG (SEQ ID N0:32)，其中DDDDK (SEQ ID NO: 33)是肠激酶的识别位点，G是连 接体，LVPRGS (SEQ ID NO: 34)是凝血酶的识别位点，G是连接体。 代表性复合肽的氨基酸序列为
KKXAKKXGKKKAKKKGDDDDKGLVPRGSGKKKAKKKGKKXAKKKY (SEQ ID NO:35)
复合肽在中性pH下的净电荷强度/残基为+22/46 +0. 5。该例种 的多层膜由指定的阳性肽和适当的阴性肽构成，例如SEQ ID NO: 29。
实例11 :具有两个功能区的复合B;t其中存在三个表面吸附区， 一个在复合肽的N末端， 一个在C末端， 一个在两个功能区之间， 并且其中存在两个相同的功能区，用于形成天然肽交叉连接。
代表性的肽结构如下
SAR-功能区-SAR-功能区-SAR
其中如前，SAR是适当的表面吸附区，例如EEEAEEE (SEQ ID N0:36)，且该功能区含有特定数目的Cys残基，例如GGCGGCGG (SEQ ID N0:37)。代表性复合肽的氨基酸序列为
EEEAEEEGGCGGCGGEEEAEEEGGCGGCGGEEEAEEEY (SEQ ID NO:38)
复合肽在pH 7时的净电荷强度/残基为-0. 5。该例中的多层膜由 指定的阴性肽和适当的阳性肽构成，例如
KKKAKJOLGK阻KKKGKKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ED NO :39)
实例12:在多肽C末端包含一个功能区和一个表面吸附区的复 合多肽
该实例中，功能区是已知的蛋白质功能结构域，例如National Center for Biotechnology Information访问号AAP06461的BAG 结构域
BAG序列-EEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO :40)
其中〃BAG序列〃代表来自日本血吸虫(Schistosoma japonicum) 的假设蛋白的BAG结构域的氨基酸序列 BAG序歹!j
SLQPEIDRFDGTPHSKEFKCLMENLEQLILSLDNLETDGNVEFRTMRRDAVKEIQ QLM EMLDYRSLISSQNDEVLAD (SEQ ID NO:41)
表面吸附区与SEQ ID NO: 13相同。
术语\"一个\"和\"一种\"和\"所述\"以及类似指示词的使用(特 别是在下述权利要求的上下文中)将解释为包括单数和复数，除非 本文以其他方式指明或与上下文明显矛盾。本文使用的术语第一、 第二等不是要指任何特定排序，而仅是为了方便表示多个例如层。
除非另有指明，术语\"包含\"、\"具有\"、\"包括\"和\"含有\"要 解释为开放型术语(即，表示\"包括但不限于\")。除非本文另有 说明，范围值的描述仅预期作为单独指落入所述范围内的每个单独 值的速记方法，并且如果每个单独值在本文单独叙述，则它被并入 本说明书。所有范围的端点包括在所述范围内，并可独立结合。本 文描述的所有方法可以以适当顺序进行，除非本文另有指明或者以 其他方式与上下文明显矛盾。除非另有声明，任何和所有实施例或 示例性语言(例如，\"例如\")的使用，预期仅为了更好地描述本 发明，并不对本发明范围产生限制。如本文使用的，本说明书的语 言都不应解释为表示任何为实施本发明所必需的非要求要素。
本发明的其他实施方案是可能的且可以做出调整而不偏离本发 明的构思和范围。因此，上面的详细描述不是要限制本发明。而且， 本发明的范围通过所附权利要求来限定。
权利要求
1.一种生产多层薄膜的方法，所述膜包含第一层和第二层，其中相邻层包含带相反电荷的聚电解质，所述方法包括共价结合一个或多个表面吸附区与一个或多个功能区，以生成复合多肽，其中所述复合多肽和所述一个或多个表面吸附区具有相同极性，其中所述一个或多个表面吸附区包含一个或多个氨基酸序列基序，所述基序由5至15个氨基酸残基组成并且在中性pH下具有大于或等于0.4的净电荷强度/残基，并且其中所述一个或多个功能区包含3至约250个氨基酸残基，其中所述复合多肽不是均聚物，长度至少为15个氨基酸残基，并且在pH 4至10范围内具有大于50μg/mL的水溶解度；以及将所述复合多肽沉积在基质或所述第二层上，以形成第一层；其中所述第二层包含第二层聚电解质，所述第二层聚电解质包含聚阳离子材料或聚阴离子材料，所述聚阳离子材料或聚阴离子材料具有大于1,000的分子量和每个分子至少5个电荷，以及一个与所述第一层聚电解质相反的电荷。
2. 权利要求1的方法，其中沉积步骤包括将所述复合多肽沉积 在基质上，并且进一步包括将所述第二层聚电解质沉积在所述第一 层上。
3. 权利要求1的方法，其中所述一个或多个表面吸附区和一个 或多个功能区通过溶液相合成、固相合成或重组肽生成而产生。
4. 权利要求l的方法，其中所述复合多肽具有大于或等于约1 mg/mL的水溶解度。
5. 权利要求1的方法，其中所述功能区包含功能基序，所述功 能基序包含3至约50个氨基酸残基，并且其中所述复合多肽在中性 pH下每个残基具有大于或等于0. 4的净电荷强度。
6. 权利要求l的方法，其中所述功能区是包含约50至约250个氨基酸残基的功能结构域。
7. 权利要求6的方法，其中所述功能结构域在pH 4至10下具 有大于50网/mL的水溶解度。
8. 权利要求6的方法，其中所述功能结构域在pH 4至10下具 有大于1 mg/mL的水溶解度。
9. 权利要求l的方法，其中所述聚阳离子材料包含聚胺。
10. 权利要求1的方法，其中所述聚阴离子材料包括核酸、藻 酸盐、角叉菜胶、帚叉藻聚糖、果胶、黄原胶、透明质酸、肝素、 硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸葡聚糖、聚甲基丙烯酸、 氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多糖和含有侧链羧基的交联羧甲 基纤维素、合成聚合物和共聚物，以及包含一种或多种上述聚阴离 子材料的组合形式。
11. 权利要求l的方法，其中所述膜是微囊形式。
12. 权利要求ll的方法，其中所述微囊包含核心，并且所述核 心包含蛋白质、药物或其组合。
全文摘要
本文公开了包含两层或更多层聚电解质的多层膜，其中相邻层包含带相反电荷的聚电解质。第一层聚电解质包含复合多肽，所述复合多肽包含与一个或多个功能区共价连接的一个或多个表面吸附区，所述功能区生成单个多肽链。所述表面吸附区包含一个或多个由5至15个氨基酸残基组成的氨基酸序列基序。所述一个或多个功能区包含3至约250个氨基酸残基。
文档编号C07K17/00GK101365724SQ200680039950
公开日2009年2月11日 申请日期2006年10月25日 优先权日2005年10月25日
发明者D·T·海尼 申请人:路易斯安那科技大学研究基金会
技术领域：
本发明涉及通过静电叠层自组装(\"ELBL〃)在适当表面上形成超
薄多层膜。更具体的，本发明涉及用于设计多肽的方法，所述多肽 用于通过ELBL纳米加工薄膜、涂层和微囊，应用于生物医药和其他 领域。
背景技术：
ELBL是已经建立的技术，其中超薄膜通过改变带相反电荷的聚 电解质的吸附而被组装。该过程是基于在每层沉积之后薄膜表面电 荷的逆转。图1显示了一般的ELBL过程的示意图带相反电荷的聚 离子(阳离子聚离子10和阴离子聚离子11)的薄膜在负电性平面 12上逐层组装；表面电荷在每层沉积之后逆转。重复该过程直至形 成所需厚度的薄膜。结合的物理基础是静电学和抗衡离子释放入溶 液后的熵增加，重力和核力实际上没有起作用。因为该过程的通用 性和相对简单性，ELBL允许很多不同类型的物质在很多不同类型的 表面上沉积。因此，存在大量可能有用的物质和表面的组合。关于 ELBL的综合性讨论包括它的历史参见YuriLvov， \"Electrostatic Layer-by-Layer Assembly of Proteins and Polyions〃 in Protein Architecture: Interfacial Molecular Assembly and Immobilization Biotechnology, Y. Lvov H. M6hwald eds. (New
York: Marcel Dekker， 1999)， pp.125- 167，其在这里通过引用整 体并入本文。
ELBL最近己经成为纳米技术领域的焦点，因为它可以被用来制 造厚度大致小于1微米的薄膜。另外，ELBL允许对薄膜制造过程的 特殊控制，实现了纳米级材料的使用，并允许纳米级的结构修饰。 因为每层的厚度都在几纳米或更少的层次上，取决于所使用的材料 的类型和特定的吸附过程，所以能够形成可精确重复厚度的多层组 装。
许多合成的聚电解质己经在ELBL应用中被采用，包括聚(苯乙 烯磺酸)钠(〃PSS〃)、聚(丙烯胺盐酸)(\"PAH〃)、聚(二甲基二烯 丙基氯化铵)(〃PDDA〃)、聚(丙烯酰胺-共-二甲基二烯丙基氯化铵)、 聚(乙烯亚胺)(〃PEI〃)、聚(丙烯酸)(〃PAA〃)、聚(茴香烯磺酸)、 聚(乙烯磺酸盐)(〃PVS〃)和聚(乙烯磺酸)。然而，这类物质并非普 遍用于生物医学应用，因为它们是抗原性或毒性的。
蛋白质，作为带有具有可电离基团的侧链的聚合物，能够在用于 各种应用的ELBL中使用，包括生物医学的应用。已经在ELBL中使 用的蛋白质的例子包括细胞色素d鸡蛋蛋清溶菌酶、免疫球蛋白G、 肌红蛋白、血红蛋白和血清白蛋白(^uV)。然而，对于使用蛋白 质用于该目的还存在困难。这些包括对多层结构的有限的控制(因 为蛋白质表面是高度不规则的且蛋白质一般不会吸附于规则结构的 表面)，对pH的限制(由于pH依赖性的蛋白质溶解度和结构稳定
性)，当使用外源性蛋白时缺乏生物相容性，和放大生产的成本(如 果基因还没有被克隆)；除非所述蛋白质在容易获得的来源(例如， 母牛)中是相同的，否则蛋白质将必须从它预期应用的生物体中获 得，这使得蛋白质的大规模生产的成本是禁止性的。
对比多肽，其一般比蛋白质小且比较不复杂，构成极好的一类用 于ELBL组装的材料，而且通过ELBL制造的多肽薄膜结构将有用于 广泛的应用。本发明提供了通过ELBL用于薄膜、涂层和微囊的纳米 加工的多肽的设计方法。使用本发明方法设计的多肽将表现几个有 用的性质，包括但不限于完全确定的一级结构、在水溶液中最低
限度的二级结构、单分散性、每单位长度完全受控制的净电荷、根 据需要形成交联的能力、逆转交联形成的能力、形成更有组织的薄 膜(比使用蛋白质可能形成的)和相对廉价的大规模生产成本(假 定基因设计、合成、克隆和宿主表达于大肠杆菌(E C^i)或酵母 中，或者肽合成)。
使用本发明方法设计的多肽已经显示有用于薄膜结构的ELBL， 所述薄膜结构在生物医学技术、食品技术和环境技术中具有定向或 可能的应用。这类多肽可以用来例如制造人工红细胞、给药装置和 抗微生物薄膜。
发明内容
本文公开了包含两层或更多层聚电解质的多层S臭其中相邻层包 含带相反电荷的聚电解质。第一层聚电解质包含复合多肽，所述复 合多肽包含与一个或多个功能区共价连接的一个或多个表面吸附 区，所述功能区生成单个多肽链，其中所述复合多肽和所述一个或 多个表面吸附区具有相同的极性。其中所述一个或多个表面吸附区 包含一个或多个氨基酸序列基序，所述基序由5至15个氨基酸残基 组成并且在中性pH下每个残疾具有大于或等于0. 4的净电荷强度。 所述一个或多个功能区包含3至约250个氨基酸残基。所述复合多 肽不是均聚物，长度至少为15个氨基酸残基，并且在pH4至10范 围内具有大于50 pg/mL的水溶解度。而且，第二层包含第二层聚电 解质，所述第二层聚电解质包含聚阳离子材料或聚阴离子材料，所 述聚阳离子材料或聚阴离子材料具有大于1,000的分子量和每分子 至少5个电荷，以及一个与所述第一层聚电解质相反的电荷。
一种生产多层膜的方法，所述膜包含第一层和第二层，其中相邻 层包含带相反电荷的聚电解质，所述方法包括共价结合一个或多 个表面吸附区与一个或多个功能区以生成复合多肽，其中所述复合 多肽和所述一个或多个表面吸附区具有相同极性；以及将所述复合 多肽沉积在基质或第二层上，以形成第一层。当沉积步骤包括将所
述复合多肽沉积在基质上时，所述方法进一步包括将所述第二层聚 电解质沉积在所述第一层上。
本发明还提供了用于在氨基酸序列信息中识别用于在ELBL中使 用的具有确定长度和中性pH下的净电荷的\"序列基序\"以及用于记录 所需数目的基序的新方法。所述方法包括步骤(a)获得来自特定 生物体的肽或蛋白质的氨基酸序列；(b)定位所述氨基酸序列中的 起始氨基酸；(c)检査所述起始氨基酸和所述随后n个氨基酸以确 定具有与所述某一极性相反的极性的荷电氨基酸的数目；(d)如果 具有与所述某一极性相反的极性的所述荷电氨基酸的数目是一或更 多，从步骤g继续该方法；(e)检查所述起始氨基酸和所述随后n 个氨基酸以确定具有所述某一极性的荷电氨基酸的数目；(f)如果 具有所述某一极性的荷电氨基酸的数目等于或大于 记录由所述起 始氨基酸和所述随后n个氨基酸组成的所述氨基酸序列基序；(g) 定位所述氨基酸序列中另一个起始氨基酸；和(h)从步骤c开始 重复所述方法直至所述所需数目的氨基酸序列基序已经被识别或者 所述氨基酸序列中的所有氨基酸已经作为步骤c中的所述起始氨基 酸被使用；其中x大于或等于约1/2 n。
本发明还提供了用于设计用于在ELBL中使用的多肽的新型方 法，包括步骤(a)使用前段提到的步骤来识别并记录一个或多个 具有某一极性的净电荷的氨基酸序列基序和(b)连接多个所述被记 录的氨基酸序列基序以生成多肽。
本发明还提供了用于设计在ELBL中使用的多肽的新型方法，包 括如下歩骤(a)重新设计多个氨基酸序列基序，其中所述氨基酸 序列基序由n个氨基酸组成，其中至少x个氨基酸是带正电且没有 一个氨基酸是带负电，或者其中至少x个氨基酸是带负电且没有一 个氨基酸是带正电，其中x是大于或等于约1/2 n;和(b)连接所 述多个所述氨基酸序列基序。氨基酸序列基序可以包含20个普通氨 基酸或非天然氨基酸，所述氨基酸可以是左旋(L-氨基酸)也可以 是右旋(D-氨基酸)。
本发明还提供了一种薄膜，该薄膜包括多个多肽层，所述多肽层
具有交替的电荷，其中所述多肽包含至少一个由n个氨基酸组成的 氨基酸序列基序，其中至少x个氨基酸带正电且没有一个氨基酸带 负电，或者其中至少x个氨基酸带负电且没有一个氨基酸带正电，
其中x大于或等于约1/2 n。这些多肽中的基序可以使用上述任一方 法来选择。
本发明还提供了使用半胱氨酸或其他含巯基的氨基酸类型来\"锁 定(lock)\"和\"解锁(unlock)\"多肽ELBL薄膜多层的方法。该方法
使薄膜在极端PH下保持稳定，对由所设计的多肽纳米加工的薄膜的 机械稳定性和扩散性质产生较强控制并增加了它们在广泛应用中的 效用。
图1是一般ELBL过程的示意图。
图2是使用本发明方法在人类氨基酸序列信息中识别的氨基酸
序列基序的累积二级结构倾向性图，与105个随机氨基酸序列的结构
倾向性分布相比较。
图3 (a)显示了由石英晶体微量天平技术rQCM\")所监测到的关
于根据本发明设计的氨基酸序列组合的吸附数据。
图3 (b)显示了由QCM监测到的关于根据本发明设计的不同氨
基酸序列组合的吸附数据的比较。
图3 (c)显示了关于根据本发明设计并制造的氨基酸序列的吸
附质量(纳克)与层数的图。
图4 (a)描述了根据本发明半胱氨酸锁定方法的内层二硫键。 图4 (b)描述了根据本发明半胱氨酸锁定方法的中间层二硫键。 图4 (c)描述了由根据本发明方法设计的多肽所制造的微囊中
二硫键的氧化和还原。
图5是用于识别现有氨基酸序列信息中具有适当的静电性质用
于ELBL的氨基酸序列基序的本发明的选择方法的示意图。
图6显示了在可获得的人类氨基酸序列数据中识别的非多余序 列基序的数目。
图7显示了来自水性介质的聚L-谷氨酸和聚L-赖氨酸的ELBL吸 附，作为离子强度的函数。
图8显示了根据本发明方法设计的多肽的吸附，用于实验以探测
二硫键形成的效果。
图9显示了在参考图8所讨论的酸性pH下的薄膜分解过程中材
料保留的百分比。
图10显示了在涉及重新设计的含有半胱氨酸的多肽的实验的酸 性PH分解步骤中材料损失的百分比。
图ll (a)描述了肽的溶液结构在薄膜组装上的作用，显示了聚 L-谷氨酸和聚L-赖氨酸的组装行为是如何依赖pH的。针对吸附层标 绘出QCM共振频率。聚L-谷氨酸的平均分子量是84600 Da，而聚L-赖氨酸的平均分子量是84000 数字指的是pH值。E=Glu， K=Lys。 用于组装的肽浓度是2 mg/mL。
图ll (b)描述了肽的溶液结构在薄膜组装上的作用，显示了聚 L-谷氨酸和聚L-赖氨酸的溶液结构是如何依赖pH的。平均摩尔残基 椭圆率被标绘为pH的函数。肽浓度是0.05 mg/mL。
图12显示了不同长度的聚电解质的吸附数据，说明长的聚电解 质比短的吸附更好。
图13描述了 \"复合\"多肽(4)的实施方案，包含两个表面吸附 (1， 2)区和一个功能区(3)。每个表面吸附区(1， 2)包含一个或多个基 序。
图14描述了通过溶液相合成、固相合成或重组肽生成来制备复 合多肽(4)的三个不同区(1，2， 3)。
图15描述了复合肽(4)的三个区(1，2， 3)通过肽合成而结合生成 一个多肽链。结合该实例三个区的其他方法是可能的。
图16描述了 3T3成纤维细胞在具有不同表面涂层的盖玻片上3 天后的增殖程度。PLL指15层聚(L-谷氨酸)(PLGA)和聚(L-赖氨酸) (PLL) 。 PLL/RGD指10层PLGA/PLL，加5层含RGD的肽，而RGD指
15层含RGD的肽。涂层通过叠层组装制备，每种情况中的末端层具 有净正电荷，未涂布的盖玻片作为对照。涂布表面显示比未涂布表 面更大的增殖程度，用PLL/RGD涂布的表面显示最大的增殖。
图17描述了 \"复合\"多肽的实施方案，包含两个表面吸附区 (120和130)和一个功能区(110)。
图18(200)描述了 \"复合\"多肽的实施方案，包含两个面吸附区 (120和130)和一个功能区(111)，连接至表面(150)。
具体实施方式
术语解释
为了在随后描述中的方便，采纳术语的以下解释。然而，这些解 释仅仅意为示例性的。它们不是意欲当术语在整个说明书中被描述 或提及时来限制这些术语。更正确的，这些解释意味着要包括如这 里所描述或主张的术语的其他方面和/或例子。
本文使用的\"层\"表示经过吸附步骤后在例如薄膜形成模板上 的薄膜厚度增加。\"多层\"表示多个(即，两个或更多)厚度增加。\"聚 电解质多层薄膜\"是包含一个或多个聚电解质厚度增加的薄膜。沉积 后，多层薄膜的层不可以保持为分离的层。事实上，可能存在明显 的物类掺混，特别是在厚度增加的界面。
本文使用的\"生物相容性\"表示在摄食、皮肤接触或引入血液后没 有引起不利的健康影响。
本文使用的\"免疫应答\"表示人类免疫系统对血液中物质存在的 响应。免疫应答能以多种方式表征，例如，通过增加血液中识别某 一抗原的抗体的数目(抗体是由免疫系统生成的蛋白质，抗原是引发 免疫应答的实体)。人体通过增加血液中抗体的数目来对抗感染和抑 制再感染。特异性免疫应答在一定程度上取决于个体，尽管普遍的 应答模式是标准的。
本文使用的\"表位\"表示被抗体识别的蛋白质的结构。通常，表位 将位于蛋白质的表面上。\"连续表位\"是包括成排的几个氨基酸的表 位，不是包括与折叠蛋白质发生接触的氨基酸残基的表位。
本文使用的\"序列基序\"和\"基序\"表示使用本发明方法识别的给 定残基数目的氨基酸序列。在优选实施方案中，所述残基数目是7。
本文使用的\"氨基酸序列\"和\"序列\"表示至少两个氨基酸残基长 度的任意长度的多肽链。
本文使用的\"残基\"表示聚合物中的氨基酸；这是由此形成所述聚
合物的氨基酸单体的残基。多肽合成包括水解，即，在氨基酸加入 多肽链时\"丢失\"单个水分子。
本文使用的\"设计的多肽\"表示使用本发明方法设计的多肽，术语 \"肽\"和\"多肽\"被互换使用。
本文使用的\"一级结构\"表示多肽链中线性的氨基酸序列，\"二级 结构\"表示由非共价相互作用(通常为氢键)包括稳定的或多或少有
规则的结构类型一例子包括a-螺旋、|3-折叠和(3-转角。
本文使用的\"氨基酸\"不限于20种通常天然存在的L-a-氨基酸； 如上下文许可，该术语还指L-氨基酸、D-氨基酸和其他非天然氨基 酸。
本文使用的\"非天然氨基酸\"表示不同于20种天然存在的氨基酸 的氨基酸。
\"类肽\"或N-取代甘氨酸表示相应的氨基酸单体的类似物，具有 与相应氨基酸相同的侧链，但是该侧链附于氨基氮原子而非残基的 a-碳。因此，聚类肽中单体间的化学键合不是肽键，这可以用来限 制蛋白水解消化。
\"基质\"表示具有供水溶液中聚电解质吸附的适当表面的固体材 料。基质表面可以具有实际任何形状，例如平面、球形、柱形等。 基质表面可以是规则或不规则的。基质可以是结晶的。基质大小范 围从纳米尺度至大尺度。而且，基质任选包含胶粒聚集。基质可以 由有机材料、无机材料、生物活性材料或其组合制成。基质硅晶片 的非限制性实例；荷电胶粒，例如CaC03或三聚氰胺甲醛的微粒；生 物细胞例如红细胞、肝细胞、细菌细胞或酵母细胞；有机聚合物晶 格，例如聚苯乙烯或苯乙烯共聚物晶格；脂质体；细胞器；和病毒。
在一个实施方案中，基质是医疗装置，例如人工起搏器、耳蜗植入 物或支架。
当基质在薄膜形成过程中或之后分解或以其他方式去除时，其被 称为\"模板\"(用于薄膜形成)。模板颗粒可以溶解于适当溶剂或 者通过热处理去除。例如，如果使用部分交联的三聚氰胺甲醛模板 颗粒，则所述模板可以通过温和的化学方法分解，例如用二甲亚砜
(DMSO)或通过pH值变化。模板颗粒溶解后，留下由交替聚电解质层 构成的中空多层壳。
〃微囊\"是中空壳或核心外涂层形式的聚电解质薄膜。所述核心包 含多种不同的密封剂，例如蛋白质、药物或其组合。
\"生物活性分子〃表示具有生物效应的分子、大分子或大分子组 装。具体的生物效应可以以适当测定法测量，来测量所述生物效应 并标准化为每单位重量或每分子生物活性分子。生物活性分子可以 封装或保留在多肽膜内。生物活性分子的非限制性实例是蛋白质、 蛋白质的功能片断、蛋白质复合物、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖 体、活性治疗剂、磷脂、多糖。本文使用的〃生物活性分子\"还包括 生物活性结构，例如功能膜片断、膜结构、病毒、病原体、细胞、 细胞聚集物和细胞器。可被封装或保留在多肽膜内的蛋白质的实例
是血红蛋白；酶，例如葡萄糖氧化酶、尿素酶、溶菌酶等；细胞 外基质蛋白，例如纤维结合蛋白、层粘连蛋白、玻璃体结合蛋白和 胶原；和抗体。可封装或保留在多肽膜内的细胞的实例是移植的胰 岛细胞、真核细胞、细菌细胞、植物细胞和酵母。
本文使用的可溶性多肽在pH 7. 0水溶液中具有大于50吗/mL的 溶解度。在另一实施方案中，可溶性多肽在pH7.0下具有大于或等 于约1 mg/mL的水溶解度。
下述三字母简称在这里用来代表20种普通氨基酸
Ala二赖氨酸 Cyr半胱氨酸 Asp^天冬氨酸
Gli^谷氨酸 Phe二苯丙氨酸 Gly二赖氨酸
His二组氨酸 Ile二异亮氨酸 Lyr赖氨酸 Leu二亮氨酸 Prc^脯氨酸 Ser二丝氨酸 Trp二色氨酸
Met二蛋氨酸 Gl『谷氨酰胺 ThF苏氨酸 Ty^酪氨酸
As『天冬酰胺
Arg二精氨酸
Val4领氨酸
A.发明描述
本发明包括包含带相反电荷的聚电解质交替层的多层薄S莫其中 所述薄膜的第一层包含设计的多肽。\"设计的多肽\"表示包含一个或 多个氨基酸序列基序的多肽，其中所述多肽长度为至少15个氨基 酸，并且在pH7.0下，相同符号荷电残基的数目减去相反符号的残 基数目，与多肽总残基数目的比值大于或等于0.4。换言之，每个残 基的净电荷强度大于或等于0.4:在另一实施方案中，在pH7.0下，
相同符号荷电残基的数目减去相反符号的残基数目，与多肽总残基 数目的比值大于或等于0.5。换言之，每个残基的净电荷强度大于或 等于0.5。在一个实施方案中，设计的多肽不是均聚物。
在一个实施方案中，聚电解质包含具有大于1， 000的分子量和每 分子至少5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料。在一个实施方 案中，聚阳离子材料包含聚胺，例如多肽、聚乙烯胺、聚(氨苯乙烯)、 聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯 酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-交联羧甲基纤维素 二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基-甲 基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基氨基 甲基丙烯酸酯)、聚(N，N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亚 胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(N，N，N-三甲基氨基丙烯酸酯 氯化物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵)、壳聚糖以及包含一 种或多种前述聚阳离子材料的组合物。在另一实施方案中，聚阴离 子材料包含多肽、核酸、藻酸盐、角叉菜胶、帚叉藻聚糖、果胶、 黄原胶、透明质酸、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、 硫酸葡聚糖、聚甲基丙烯酸、氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多
糖、交联羧甲纤维素、含有侧链羧基的合成聚合物和共聚物，以及 包含一种或多种前述聚阴离子材料的组合物。
本发明还提供了用于通过ELBL纳米加工薄膜、涂层和微囊的多 肽的设计方法，用于在生物医学和其他领域的应用。所述方法包括5 个主要的设计，其关注(1)多肽的静电性质；(2)多肽的物理 结构；(3)从多肽制造的薄膜的物理稳定性；(4)多肽和薄膜的 生物相容性；和(5)多肽和薄膜的生物活性。第一个设计关注，静 电学，可能是最重要的，因为它是ELBL的基础。没有适当的电荷性 质，多肽将不溶于水溶液中并不能用于薄膜的ELBL纳米加工。我们 已经设计了新型的方法，用于识别氨基酸序列信息中具有适合于 ELBL的静电性质的氨基酸序列基序。
用于ELBL的多肽的二级结构也是重要的，因为薄膜的物理性 质，包括它的稳定性，将取决于肽的溶液结构如何转变为它在薄膜 中的结构。图11描述了某些多肽的溶液结构如何与薄膜组装相关。 (a)显示了聚L-谷氨酸和聚L-赖氨酸的组装行为是如何依赖pH 的。显然，oi-螺旋构型与沉积材料的相关程度高于卩-折叠构型。这 一行为的精确分子解释有待阐明。(b)显示这些肽的溶液结构是如 何依赖pH的。在pH4.2时，聚L-谷氨酸大多是or螺旋，如同聚L-赖氨酸在pH 10. 5时。两种多肽在pH7. 3时都是大多为无结构的线 团状构型。
余下的关注涉及多肽薄膜的应用。在实施本发明中，将根据特定 应用的设计要求将或多或少的权重放在这些其他关注上。
通过使用本发明的选择方法以在氨基酸序列信息中识别具有适 当的电荷特征的氨基酸序列基序并利用其他设计关注以选择特定基 序，能够设计适合于ELBL制造应用于生物医学和其他领域的纳米结 构薄膜的多肽。或者，可以使用本发明的方法来重新设计用于在ELBL 中使用的多肽。所述重新设计的方法基本上与在现有氨基酸序列信 息中识别基序的方法相同，除了氨基酸序列基序中每个残基是由实 施人员选定而非在特定生物体的基因组或蛋白组信息中被识别的完 整基序。必须强调的是，关于新生多肽的设计，本发明所举出的基
本的多肽设计原则不依赖于所涉及的氨基酸是否为20种普通天然存 在的氨基酸、非天然氨基酸或它们的一些新型组合。而且，其他D-
氨基酸和L-氨基酸都能够被使用。
本发明的设计关注在下面更详细的讨论。 1.静电学
我们已经设计了用于在氨基酸序列信息中识别具有适合用于
ELBL的静电性质的氨基酸序列基序的方法。使用该方法，我们己经 在人类蛋白质组数据一编码人体中所有已知蛋白质的基因组的蛋白 质翻译一中识别了 88315个非多余氨基酸序列基序。该信息可通过 美国国立生物技术信息中心(\"NCBI〃)网 站http:〃ww. ncbi. nlm. nih. gov等公开获得。这类信息随人类基 因组的进一步分析而被经常更新。随着这类信息的增加，在人类序 列信息中通过本发明的选择方法能够被识别为具有用于ELBL的适当 的静电性质的氨基酸序列基序的数目也将增加。对于任何生物体而 言都是同样的。被接受的生化和物理学原理以及下面描述的实验结 果表明，被识别的序列基序将对于用于ELBL结构的纳米加工的多肽 的设计是有用的。
关键的选择标准是在中性pH (pH7，接近人类血液的pH)下每单
位长度的平均电荷。另外，有几个结构的优选。首先，优选的是每 个氨基酸序列基序由仅7个残基组成。 a.基序中残基的总数
在优化生物相容性、物理结构和非多余序列基序数目的努力中， 长度为7的基序在可获得的氨基酸序列数据中被选择。
如下所讨论的，氨基酸序列基序上每个残基的净电荷强度大于或 等于0.4。在一个实施方案中，每个序列基序中至少半数氨基酸残基 是荷电的，这样，氨基酸序列基序上每个残基的净电荷强度大于或 等于0.5。而且，优选但非必须的，每个基序的所有荷电残基具有相 同电荷。这些要求保证了每个基序可充分溶解于水溶剂，并在中性 pH下具有足够的电荷用于ELBL。因为只有相对小比例的氨基酸类型 是带电的，当给定氨基酸序列长度增加时，所述序列具有足够比例
的适当荷电氨基酸用于ELBL的几率降低。对于大小为7的基序，4 个荷电氨基酸是优选最低限度的，因为少于4个电荷，产生实质降 低的肽溶解度和降低的对ELBL的控制。
关于生物相容性(下面进一步讨论)，每个被识别的序列基序是 足够长的以在7个残基上构成连续表位(相关于设计的肽可能被引 入其中的生物体的可能的免疫应答)，但不是长至完全符合在蛋白 质表面上和其内部的残基；电荷要求帮助确保序列基序在折叠蛋白 质的表面出现；荷电残基不能形成于折叠蛋白的核心。相反，非常 短的基序可能对于机体而言是随机的序列或者非特别\"自我\"的序 列，并因此引发免疫应答。尽管用于生成抗体的肽的理想长度是一 些争论点，但大部分肽抗原的长度范围从12至16个残基。9个残基 或更短的肽可以是有效的抗原；长于12或16个氨基酸的肽可以含 有多个表位(Angeletti， R. H. (1999) Design of Useful P印tide Antigens, / ^j\'o历o丄7fec力.10:2-10，其因此通过引用整体并入 本文)。因此，为最小化抗原性，可以优选短于12以和更好的短于9 个残基的肽。
优选的基序不应该太长的另外一个原因为最小化二级结构的形 成。二级结构降低了多肽(见下文)和由它们制成的薄膜的物理结 构的控制。因此，氨基酸序列基序应该含有5至15个连续氨基酸。
而l当每个基序的残基数目为7时发现了最大数目的非多余基 序。图6显示了在可获得的人类氨基酸序列信息中的非多余基序的 数目。阳性基序的最大数目是对于5个氨基酸长度，而阴性基序的 最大数目是对于7个残基长度。阳性和阴性基序的最大数目对于5 和7是大约相同的。因此，7个残基的基序长度似乎将最大化非多余
基序的数目。
由于所有的上述原因，7个残基是以优化用于ELBL的多肽设计 的优选的基序长度。然而，有可能在一些情况下，稍微更短的或稍 微更长的基序也将同样起作用。例如，可以采用5或6个残基长度 的基序，而长度处于8-15个残基级别的基序也可能是有效的。因此， 7个残基的基序长度似乎将最大化非多余基序的数目。
b.荷电残基的数目
第二，优选地至少4个荷正电的(碱性的)氨基酸(Arg、 His或 Lys)或至少4个荷负电的(酸性的)氨基酸(Glu或Asp)在中性pH 下存在于每个7残基的基序中。在致力于保证中性pH下足够高的电 荷密度时，不赞成正电荷和负电荷的组合。然而，同时含有阳性氨 基酸和阴性氨基酸的基序可能用于ELBL。例如，稍微更长的(约9 个残基)基序可以具有6个荷正电的氨基酸和1个荷负电的氨基酸。 重要的是净电荷强度(即，静电荷的绝对值)一整个肽必须在中性PH 下是或者足够荷正电或足够荷负电的。然而，所述基序的优选的实 施方案将只含有Glu或Asp或者只含有Arg、 His或Lys作为荷电氨 基酸(尽管其他非荷电氨基酸可能并且通常是形成基序的部分)， 除非非天然氨基酸被允许作为酸性或碱性氨基酸。
图5是显示在用于识别具有适当的静电性质的氨基酸序列的选 择过程中所涉及的步骤的流程图。假定只有20种普通氨基酸被涉 及。如果寻找荷负电的基序，所述过程从定位序列数据中的氨基酸 开始。该氨基酸将被称为\"起始氨基酸\"，因为它是用于分析周围氨 基酸的起始点(即，它将开始所述基序)。接下来，对起始氨基酸 和随后6个残基检查Arg、 His或Lys的出现。如果一个或多个Arg、 His或Lys位于这7个氨基酸中，该过程在另一个起始氨基酸重新开 始。如果没有发现Arg、 His或Lys，对这7个氨基酸检査以确定Glu 和/或Asp出现的数目。如果Glu和/或Asp在这7个残基中出现至 少4次，则该序列基序被编入目录。所述选择过程对荷正电的氨基 酸基本相同，除了分别地Glu和Asp被Arg、 His和Lys所取代以及 Lys被Glu和Asp所取代之外。显然，也可以在氨基酸序列的起始端 (氨基末端)开始该方法并进行至结束端(羧基末端)，或者，可 选地，可以在随机位点开始并随机地或者系统地以任一方向完成序 列中所有的氨基酸。而且，可以使用该方法来识别序列信息中含有 非天然氨基酸的基序，例如，如果密码子被用来代表各非天然氨基 酸类型。在这种情况下，可以搜寻分别代替Glu和Asp以及Arg、 Lys 和His的非天然的酸性或碱性氨基酸。
在一个实施方案中， 一个或多个第一氨基酸序列基序由5至15
个氨基酸组成，其中所述第一氨基酸序列上每个残基的净电荷强度
大于或等于0.4。另一实施方案中， 一个或多个第一氨基酸序列基序 由n个氨基酸组成，其中在pH7时所述第一氨基酸序列上每个残基 的净电荷强度大于或等于约1/2 n，并且其中n为5至15。
其余的设计关注，即物理结构、物理稳定性、生物相容性和生物 功能性，主要涉及将使用设计的多肽的特定应用。如上所述，将根 据特定应用所需的肽性质在设计过程中或多或少地权衡这些关注。
2.物理结构
关于氨基酸序列基序的一个设计关注是它们形成二级结构的倾 向性，特别是or螺旋或P-折叠。我们已经在几个途径寻求控制、显 著最小化所设计的多肽在含水介质中的二级结构，以最大化对薄膜 层制造的控制。首先，优选地所述序列基序是相对短的，因为长基 序更容易在溶液中采用稳定的三维结构。第二，我们在多肽设计的 优选实施方案中的每个基序之间设置了甘氨酸残基。甘氨酸具有非 常低的cx-螺旋倾向性和非常低的P-折叠倾向性，使其积极地非常不 利于甘氨酸和其邻近氨基酸在水溶液中形成规则的二级结构。脯氨 酸在一些方面具有类似的性质并能够作为甘氨酸的替代物被用来连 接基序。第三，我们已经寻求最小化所设计的多肽自身的a-螺旋或 卩-折叠倾向性，通过关注累积a-螺旋倾向性小于7. 5和累积p-折叠 倾向性小于8的基序(\"累积\"倾向性表示基序中所有氨基酸的or螺 旋或P-折叠倾向性的总和)。然而，在一些情况下，具有高几分的累 积(X-螺旋倾向性和/或(3-折叠倾向性的氮基酸序列将可能适合用于 ELBL，因为基序间的Gly (或Pro)残基将在抑制稳定的二级结构在 所设计的多肽形成中起关键作用。事实上，在某些应用中可能希望 多肽的倾向性以形成相对高级的二级结构作为薄膜制造的特殊设计 特征；如上所述，依然必须满足对ELBL的必要的静电电荷要求。
为了能够选择具有所需二级结构倾向性的氨基酸序列，我们首先 使用Chou和Fasman的方法(见P. Chou和G. Fasman历oc力e肌\'W/y 13:211 (1974)，其全部内容通过引用并入本文)为全部20个氨基酸
计算了二级结构倾向性，利用来自超过1800个高分辨率的X射线晶 体结构的结构信息(1334个含有a-螺旋和1221含有p折叠股 (P-strands))。结构选自蛋白质数据库(Protein Data Bank,公 共可获得的蛋白质结构库)，基于(a)结构测定方法(X-射线衍射)； (b)分辨率(好于2.0A)—这里的\"分辨率\"指如在Rayleigh标准中 能够分辨的最小尺寸；和(c)结构多样性(被用来计算各种氨基酸的 螺旋和折叠倾向性的蛋白质晶体结构之间少于50%的序列同一性)。 其原理是选择由最可靠的方法学所确定的高分辨率结构并通过具有 相似结构而不偏移倾向性计算。接下来，使用个人计算机中的随机 数字发生器生成100000个非多余性随机序列用于比较。然后，我们 计算了使用上面(A) (l)部分中描述的选择方法所识别的88315个氨 基酸序列(59385个非多余性碱性序列基序和28930个非多余性酸性 序列基序)的二级结构倾向性。然后将所述随机序列的倾向性与所 选择的序列的倾向性进行比较。图2显示了在这些序列基序中的二 级结构形成的分布。图2中的矩形突出了我们已经识别为最小限度 可能形成基于二级结构倾向性的二级结构的序列基序。 3.物理稳定性
另外一个设计关注是多肽ELBL薄膜的稳定性的控制。离子键、 氢键、范德华相互作用和疏水性相互作用为ELBL薄膜提供了一些尽 管相对有限的稳定性。相反，共价的二硫键可以提供特殊的结构强 度。我们已经设计了使用半胱氨酸(或一些其他类型的含巯基氨基 酸)来\"锁定\"和\"解锁\"相邻的ELBL薄膜多肽层的新型方法。该方法 使多肽纳米加工的薄膜能够在极端PH下保持稳定，产生对其机械稳 定性和扩散性质的较强控制(关于由非多肽聚电解质制成的多层薄 膜的多孔性的讨论，参见Caruso, F. ， Niikura， K. ， Furlong, N. 和Okahata (1997) L3塔廳\'rl3:3427以及Caruso, F. ， Furlong, K Ariga， K. , Ichinose， L禾口Kunitake, T. (1998)力3/7g丽\'r 14:4559, 两者在这里都通过引用整体并入本文)。而且，在所设计的多肽的序 列基序中整合入半胱氨酸(或一些其他类型的含巯基氨基酸)实现 了相对短的肽在薄膜制造中的使用，由于分子间二硫键的形成。没
有半胱氨酸，这种肽一般不能生成足够稳定的薄膜(见图12，如下讨 论)。因此，我们新颖的半胱氨酸的使用将避免需要在大部分可能 的应用中生成昂贵的长类型的设计的多肽。这将特别有利于要在被 包裹的材料上制造薄膜的情况，所述材料如小的药物晶体、小球状 的血红蛋白晶体或含有血红蛋白的溶液。
对于其中薄膜物理稳定性是重要的应用，含有半胱氨酸(或一些 其他类型的含巯基氨基酸)的氨基酸序列基序可以选自使用上述方 法识别的基序文库，或者使用上述原理进行重新设计。然后，能够 根据所选自或设计的氨基酸序列基序设计并形成多肽。 一旦多肽被 化学合成或在宿主生物体中生成，则在还原剂存在完成含有半胱氨
酸的肽的ELBL组装，以防止过早的二硫键形成。紧接着组装，还原 剂被去除并加入氧化剂。在氧化剂存在下，半胱氨酸残基之间形成 二硫键，从而一起\"锁定\"含有它们的多肽层。
该\"锁定\"方法可以使用下面的特定的微囊制造的例子来进一步 描述。首先，含有半胱氨酸的设计的多肽被用来在适当荷电的球形 表面上通过ELBL制造多层，正常在中性pH下并含有二硫苏糖醇 (〃DTT\")(—种还原剂)的水溶液中。接下来，通过过滤、渗滤或其 他现有技术中已知的类似方法去除DTT，引起胱氨酸形成配对的半胱 氨酸侧链并从而稳定薄膜。如果肽多层被构建在含有希望包裹的物 质(例如晶状体物质)的核心颗粒上，所述制造过程是完全的并且 能够随后使所述核心颗粒在被包裹的环境中溶解，例如通过pH的改 变。然而，如果所述多层被构建在\"对照剂\"核心颗粒上，则所述核 心必须被去除。当例如三聚氰胺甲醛颗粒(〃MF〃)时， 一般通过降低 pH溶解核心一溶解是酸催化的。随着核心的溶解，溶液的pH被调至 4其中肽多聚阴离子上的部分电荷使微囊可半渗透的(compare Lvov 等人(2001) 7V朋0 Ze\"ers 1: 125，其由此整体并入本文)。接下 来，lOmM的DTT被加至微囊溶液以减少胱氨酸至半胱氨酸。然后微 囊可以被\"装填\"，通过将它们转移至将要被包裹的材料的浓缩溶 液，例如，蛋白质(ibid)。所述蛋白质通过移下其浓度梯度而进入,
微囊。微囊化的蛋白质通过去除还原剂和加入氧化剂而被\"锁入\"， 从而促进二硫键的形成。
本发明的半胱氨酸\"锁定\"和\"解锁\"的方法示意图在图4中显示。 半胱氨酸能够同时形成分子内和分子间的二硫键。进一步的，二硫 键能够在同一层或相邻层中的分子间形成，取决于薄膜中含有半胱
氨酸的肽的位置。参考图4 (a)，碱性多肽2通过二硫键3在其中 碱性肽含有半胱氨酸的所有层中连接。插入层(图中由半透明层4 表示)的酸性肽不含半胱氨酸。然而，如果酸性和碱性侧链在周围 环境的pH下荷电，则交替层继续静电相互吸引。参考图4(b)， 二硫 键在层间显示。这种结构将在用于ELBL的酸性和碱性多肽(即交替 层)同时含有半胱氨酸并且所使用的方法己经适合于二硫键形成的 时候形成。参考图4(c)，还原和氧化反应通过分别断裂和形成二硫 键3被用来调节被包裹的化合物5的释放，并从而调节颗粒通过囊 壁的扩散。
半胱氨酸\"锁定\"和\"解锁\"是调节ELBL薄膜结构完整性和渗透性 的新颖方法。现有技术已知戊二醛能够被用来交联蛋白质，这种化 学物质因此能够被用来稳定多肽薄膜。然而，戊二醛交联是不可逆 的。相反，本发明的半胱氨酸\"锁定\"和\"解锁\"方法是可逆的并因此提 供了对结构形成更好的控制，并且重要的是提供了能够使用本发明 方法制造的薄膜和胶囊的应用。血液是一种氧化环境。因此，在某 一生物医学应用中，例如由设计的多肽所制造的人工红细胞或给药 系统，在二硫键形成后将Cys-交联的多肽薄膜暴露于血液或一些其 他氧化环境不预期引起这些键的断裂。最后，还应该注意，涉及非 天然氨基酸的应用将使用一些其他的含巯基氨基酸类型取代Cys。例 如巯基能够被加至P-氨基酸如D，L-(3-氨基-(3-环己基丙酸D,L-3-氨基丁酸；或5-(甲基硫)-3-氨基戊炔酸(见 http://www. synthatex. com)。
4.生物相容性
生物相容性是生物医学应用中的主要设计关注。在这类应用中， 本发明的实施者将旨在识别会产生\"免疫惰性\"多肽的基因组或蛋白
组信息，特别是如果形成或包裹的对象将与循环血液接触。为了本 发明的目的，优选地，上述(A)(1)部分中讨论的选自过程被用来分 析血液蛋白的氨基酸序列。这将使最小化生物体免疫反应的机率最 大化。
存在用于预测氨基酸序列抗原性的计算机算法。然而，这类方法
在现有技术中已知为至多是半可靠的。在本发明中，使用上面(A) (1)
部分中讨论的选择方法所识别的序列基序是高极性的。因此，所述 基序必须出现在天然状态蛋白质的表面，其中基序是所述蛋白质的 部分。\"表面\"是折叠蛋白质与溶剂相接触的部分或因为水的粒状性 质而难以独自接近溶剂的部分。\"内部\"是折叠蛋白质因任何其他原 因而难以接近溶剂的部分。折叠的球状可溶性蛋白类似有机晶体， 内部被稠密地包裹如在晶格中而外部与溶剂水相接触。因为它们的 电荷性质，使用本发明方法识别的多肽序列基序必须主要(如果不 是唯一地)发生在蛋白质表面上。因此，当所述蛋白质在血液中时， 使用本发明的选择方法在人类血液蛋白中识别的所有序列基序总是 与免疫系统有效地接触。这适用于可以在血液中数目增加的蛋白质 的所有构型，包括变性状态，因为这高度积极不利于传递电荷从水 介质至低价电解质(如存在于蛋白质内部)。因此，被接受的生化 原理表明，使用本发明方法从血液蛋白设计的多肽或者不会引发免 疫应答或者引发最低限度的免疫应答。同样的原因，使用本发明方 法设计的多肽应该是可生物相容的。不仅是血液蛋白中的那些，使 用本发明的选择方法从基因组数据中识别的所有序列基序都应该是 可生物相容的，尽管免疫应答或任何其他类型的生物反应的程度很 可能依赖于序列基序的特定细节(因为基序所基于的多肽序列实际 存在于所述薄膜为之制造的生物体中，这种方法将至少原则上同样 适合用于任何类型的生物体。例如，该方法可以对兽医科学具有重 要价值)。免疫反应和生物相容性对设计的肽在生物医学应用中的 用途都是重要的，包括但不限于生产人工红细胞、给药系统或用于 制造生物相容性薄膜以包裹用于长期或短期引入生物体的植入物的 多肽。
5.生物活性
在多肽薄膜、涂层或微囊的一些应用中，期望调整多肽的设计来 包括用于某一结构层(通常是最外层)的功能性结构域。这里的功 能性结构域是具有特定生物功能性(例如结合磷酸酪氨酸)的蛋白 质的独立地热稳定区域。现有技术中已知这种生物功能性可以与多 结构域蛋白质中的其他功能性整合，例如在张力蛋白中，其包括磷 酸酪氨酸结合结构域和蛋白质酪氨酸磷酸酶结构域。在设计的多肽 中包括这种结构域可以许多方式行使功能，包括但不限于特异性配 体结合、细胞内靶向、生物传感或生物催化。
在一个实施方案中，多层膜包含第一层复合多肽，所述第一层复 合多肽包含与一个或多个功能区连接的一个或多个表面吸附区，其 中所述第一层复合多肽和所述一个或多个表面吸附区具有相同极 性。所述表面吸附区包含一个或多个氨基酸序列基序。所述第一层
复合多肽长度至少为15个氨基酸，并且在pH 4至10的水溶液中具 有大于50 ng/mL的溶解度。在一个实施方案中， 一个或多个表面吸 附区和一个或多个功能区具有相同极性。在另一实施方案中，所述 第一层复合多肽在pH 4至10时的溶解度大于或等于约1 mg/mL。溶 解度是实际的限制，以促进多肽从水溶液沉积。复合多肽聚合度的 实际上限为约l，OOO个残基。但是，可以想象，更长的复合多肽可 以通过适当的合成方法来实现。
在一个实施方案中，复合多肽包含一个功能区和一个表面吸附 区，其中所述表面吸附区包含两个氨基酸序列基序。在另一实施方 案中，复合多肽(4)包含一个功能区(3)和两个表面吸附区(1，2)， 一 个吸附区连接至功能区的N末端，而另一吸附区连接至功能区的C 末端，其中每个表面吸附区包含一个或多个氨基酸基序，并且两个 表面吸附区相同或不同并具有相同的极性(图13)。表面吸附区的目 的是使多肽能够吸附在带相反电荷的表面上，以构建多层膜。功能 区的目的是为所述膜提供特定功能性，例如生物功能。其他类型的 功能是可能的。例如，在一个实施方案中，功能区赋予多肽多层以 高度特异性结合二价钙离子的能力，因为在此情况下，功能区是已 知的钙结合蛋白质基序，例如人乳蛋白(x-乳白蛋白的钙结合环。即 使一些生物大分子表现出这种能力，并且实现这种结合的肽结构己 经被设计成多层膜，但是多层膜高特异性结合钙离子的能力决不是 生物的。
相对功能区的数目和/或长度的复合多肽中表面吸附区数目与溶 解度需求有关。例如，如果功能区是短的氨基酸序列，例如\"RGD\"，
即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，则仅需要一个至少12个氨基酸残基的
氨基酸序列基序来吸附复合多肽至适当荷电表面上。相对比，如果
功能区是适当折叠的蛋白质结构域，例如包含120个氨基酸残基， 则通常两个氨基酸序列基序将足以赋予复合多肽足够的电荷以使其 为水溶性的并适合吸附。所述基序可以是连续的并位于结构域的N 末端，或者是连续的并位于结构域的C末端，或者是不连续的，一 个位于N末端而一个位于C末端。
与复合肽功能区的氨基酸残基数目相比较结合的表面吸附区长 度与由于热能的分散更有关，所述分散必须在复合肽吸附的同时被 克服。因此，将功能区聚合度提高至两倍不一定需要表面吸附区长 至复合肽表面吸附区有效结合长度的两倍。复合肽与表面的吸附的 物理基础是静电吸引(和抗衡离子释放至总体溶液)，结构域的精 确质量对于纳米长度尺度是次重要的，抵抗复合肽吸附的主要 \"力\"是热能，鉴于此，本领域技术人员能够容易设计适合物理吸 附至特定目标功能区表面的表面吸附区。
一个功能区包含3至约250个氨基酸残基术语功能区包括功能 基序和功能结构域。功能基序包括相对少的氨基酸残基，因此一般 不具有紧密或持久的三维结构;但是，它们可以表现出特定功能性， 如一些肽激素和神经肽的功能，并且它们可以包含二级结构元件例 如or螺旋和(3-折叠。功能基序的实例由细胞外基质蛋白纤维结合素 的RGD序列提供。当功能单元是功能基序时，其通常包含3至约50 个氨基酸残基。当功能区是结构域时，其通常包含约50至约250个 氨基酸残基。
功能区在本文定义为至少多肽的一部分，当折叠时产生其自身的 疏水核心。例如，天然蛋白可以含有多个结构域，每个结构域作为 独立的结构和功能单元起作用。 一个结构域的生物功能可以完全独 立于另一个结构域的功能，如同一肽链中的催化结构域和结合结构 域的情况，其中这两个结构域彼此完全不相互作用。天然蛋白中结 构域之间的结构相互作用不仅是可能的，而且是相对普遍的；在这
些情况下， 一个结构域与另一结构域之间的相互作用可以视为一种 四级结构。
本文使用的功能结构域通常具有最少约50个氨基酸残基和最大 约250个氨基酸残基。原则上，蛋白质的任何功能结构域可以用于 本文描述的复合肽，只要复合多肽具有用于ELBL沉积的适当水溶解 度。在一个实施方案中，功能结构域在pH 4至10具有大于50昭/mL 的水溶解度。在另一实施方案中，功能结构域在pH 4至10具有大 于1 mg/mL的水溶解度。在另一实施方案中，当功能单元包含功能 结构域时，第一层复合多肽包含至少两个氨基酸序列基序。
当复合多肽包含替代功能结构域的功能基序时，其每个残基的净 电荷通常大于或等于0. 4。但是，如果功能基序具有小于0.4的净电 荷/残基，则一个或多个表面吸附区的每个残疾通常会具有大于0.4 的净电荷，以补偿并给予复合多肽适当的电荷性质，用于溶解性和 物理吸附。
包括在复合多肽中的适当功能区包括控制薄膜稳定性和/或封 囊物质从薄膜/胶囊释放的含半胱氨酸的基序或蛋白酶识别部位；控 制免疫原性的T细胞表位、B细胞表位或细胞毒性T淋巴细胞表位； 适合通过酶催化连接单糖或多糖的序列，例如，如在N-联或O-联糖 基化中；控制表面功能性和组织工程的细胞外基质蛋白中的肽识别 序列；控制抗微生物性质的抗细菌肽的序列；用于体内特异性耙向 跨膜受体的细胞外结构域；和用于控制二价阳离子结合的阳离子结 合基序，例如EF手基序。
在一个非限制性实施方案中，复合肽的功能区包含蛋白酶识别序 列。适当的蛋白酶识别序列包括例如Xa因子识别序列He-Glu/
Asp-Gly-Arg I ，肠激酶识别序列Asp-Asp- Asp-Asp-Lys I ，凝血酶 识别序列Leu-Val- Pro-Arg I Gly-Ser ， TEV蛋白酶识别序列 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln i Gly， PreScissionTM蛋白酶识别序列 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln I Gly-Pro等。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区包含T细胞表位、 B细胞表位或细胞毒性T细胞表位。本文使用的\"T细胞表位\"指由 T细胞识别的任何肽抗原决定子。本文使用的\"B细胞表位\"指由B 细胞免疫球蛋白受体识别并且当施用至动物时能够在T细胞适当辅 助下引发抗体生成的任何肽抗原决定子。本文使用的\"细胞毒性T 淋巴细胞表位\"指由细胞毒性T淋巴细胞识别的任何肽抗原决定 子。所述表位是由病毒、细菌、真菌或寄生虫产生的多肽。有时， 所述表位可以是连接或能够连接单糖或寡糖的多肽，例如通过N-联 或O-联糖基化。
糖基化是在大部分真核细胞中发生的普遍且高度多样的蛋白质 修饰反应。这种修饰可以分为两大类，N-联和O-联。在N-联中，碳 水化合物部分连接至天冬酰胺侧链的酰胺氮，此时天冬酰胺是共有 序列Asn-X-Ser/Thr的部分。该信号对于糖基化是必要但非充分的， 例如，X不能是Pra并且当Pro刚好在Ser/Thr糖基化下游出现时， 糖基化被抑制，在0-联糖基化中，碳水化合物部分连接至Ser或Thr 的羟基氧；其还可以发生为酪氨酸的初步修饰和5-羟赖氨酸和4-羟 脯氨酸的次生修饰。在O-联糖基化位点周围高频率出现Pro、 Ser、 Thr和Ala残基。
线性表位是由沿聚合物链的氨基酸残基连续串构成的片断。通常 的线性表位长度约5至约30个氨基酸。相反，构象表位由两个或更
多个不连续的片断构成，所述不连续的片断通过抗原折叠成其天然 结构而结合在一起。构象表位一般对应的肽链比线性表位对应的肽 链更长。任一类型的表位都可以用作LBL的复合多肽的功能区。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区包含来自抗细菌肽 的序列。抗微生物肽包括例如延缓微生物生长的抑制性肽、有效杀 伤微生物的微生物肽(例如，杀菌和杀狂犬病毒的肽药物、杀菌剂
和消毒剂)以及有效干扰微生物繁殖、宿主毒性等的肽。抗微生物
肽的实例包括尼生素、杆菌素(carnobacteriocins) B2和BM1、明 串珠菌素(leucocin) A、肠膜菌素Y105、 sakacins P和A以及 curvacin A。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区是用于细胞外基质 (ECM)识别的肽识别序列。 一个这样的序列，RGD，出现在各种细 胞外基质蛋白中，并且是整联蛋白跨膜受体分子的关键识别序列。 另一ECM识别序列是GFOGER、 GLOGER或GASGER，其中\'O\'代表羟脯
氨酸。这些是用于胶原结合整联蛋白的胶原中的识别序列。两种识 别序列都适合用于LBL的复合肽的功能区。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区是信号传导基序， 由用于体内特异性靶向的细胞表面受体识别。受体的细胞外区域将 结合具有显著特异性的肽或蛋白质信号配体。肽或蛋白质配体可以 是肽激素(例如，胰岛素、加压素、催产素)、生长因子(例如VEGF， PDGF， FGF)等。这种信号序列适合用于LBL的复合肽的功能区。在 这样的情况下，用于LBL的复合肽的功能区通常是功能基序。类似 地，膜受体的细胞外区域适合用于LBL的复合肽的功能区。这样的 情况下，用于LBL的复合肽的功能区通常是功能结构域。
在另一非限制性实施方案中，用于LBL的复合肽的功能区是用于 控制二价阳离子结合的阳离子结合基序，例如EF手基序。其他阳离 子结合结构域包括C2结构i恭\"VSFASSQQ\"基序和dockerin结构域。
在另一非限制性实施方案中，复合肽的功能区是磷酸酪氨酸识别 结构域，例如蛋白酪氨酸磷酸酶结构域、C2结构域、SH2结构域或 酪氨酸磷酸酶结合结构域。来自多种不同蛋白质的该结构域对于独 立折叠单元是已知的。
在另一非限制性实施方案中，功能结构域是聚脯氨酸识别结构 域，例如SH3结构域。
复合多肽的每个独立区域(即，功能区和表面吸附区)可以通过 溶液相合成、固相合成或适当宿主有机体的基因工程来单独合成。 溶液相合成是用于生产目前市场上批准的大部分肽药物的方法。N
末端表面吸附区(l)、 C末端表面吸附区(2)和功能区(3)可以单独合 成(图14)。溶液相方法可以用来合成相对长的肽和甚至小的蛋白 质。通过溶液相方法制备的最长的肽是降钙素(32mers)。更普遍地， 该方法用来以多达数百千克的量制备小或中长度的肽。可以在遵循 良好生产规范的工厂里生长这么大量的所需肽。
或者，各个独立区域可以一起作为单个多肽通过溶液相合成、固 相合成或适当宿主有机体的基因工程而合成。任何具体情况下的方 法选择将依据方便或经济。
如果各个功能区和表面吸附区被单独合成则例如通过离子交换 色谱后高效液相色谱纯化后，它们通过肽键合成而结合。例如，N 末端表面吸附区(1)、功能基序(3)和C末端表面吸附区(3)可以单独 合成，然后结合生成复合多肽(3)(图15)。该方法类似于所谓的杂 交合成，其中带有完全保护侧链的肽片断通过固相技术合成，然后 通过溶液相或固相方法的肽键而结合。这种杂交方法已经用来合成 T20， 一种36个氨基酸残基的肽，但是它还没有被广泛利用。
图17描述了包含2个表面吸附区(120和130)和1个功能区(110) 的\"复合\"多肽的实施方案。120是N末端表面吸附区。130是C末 端吸附区。每个表面吸附区包含一个或多个基序。\"复合\"多肽是 表面吸附区和功能区在单个多肽链中的独特组合。连接体肽序列 (140)可以用来产生在单个多肽链中包含多个功能区的复合多肽。在 一个实施方案中，功能区110可以是包含约50至约130个氨基酸残 基的小功能区，并且具有约2nm的直径。在替代实施方案中，功能 区110可以是包含约250个氨基酸残基的大功能区并且具有约4nm 的直径。16个氨基酸残基在伸展构型时的长度为约5. 5 nm。
图18 (200和300)描述了与表面(150)连接的包含2个表面吸附 区(120禾Q 130)和1个功能区(lll， 112)的\"复合\"多肽的实施方 案。图18的实施方案200描述了与表面(150)连接的包含2个表面 吸附区(120和130)和1个功能区(1U)的\"复合\"多肽，其中功能 区1U代表包含约50至约130个氨基酸残基的小功能区，并且具有
约2 nm的直径。小功能区111可以是短肽序列，例如RGD。 120是N 末端表面吸附区。130是C末端吸附区。
图18 (300)进一步描述了包含2个表面吸附区(120和130)和1 个功能区(112)的\"复合\"多肽，其中功能区112代表包含约250个 氨基酸残基的大功能区，并且具有约4nm的直径。大功能结构域112 可以是蛋白质的结构域，例如张力蛋白的PTP结构域。120是N末端 表面吸附区。130是C末端吸附区。
构建复合肽的模拟方法的优点包括利用了之前所述的氨基酸序 列基序技术，使风险最小化。其他优点包括有关几乎任何可以想象 的功能区方法的共性；以及含有相同或不同功能区和相同或不同表 面吸附区的具有相同符号电荷的化学上不同的肽可以同时被吸附， 产生了所需要的单功能或多功能表面。作为单个构建块合成表面吸 附区和功能区的优点包括预制备和实际不确定地保存(通过冻干) 单个构建块，以准备待用；通过使用大量制备的保存的构建块低成 本生产特定功能性的复合肽；与直接固相、溶液相或生物合成相比 较，快速制备复合肽；因为模拟合成方法而对有关功能区的新发展 做出快速反应；以及使用基于完全合成的肽和多肽层材料作为最小 化微生物污染的方式，从而简化了美国食品药品监督管理局对产品 的审批。
C.使用本发明方法设计的多肽的用途
如上所述适当的设计的多肽是用于ELBL的优良材料使用ELBL 制造的多肽薄膜结构将有用于许多不同类型的应用。使用本发明方 法设计的多肽已经表明有用于薄膜结构的ELBL，用于在生物医学技 术、食品技术和环境技术中可能的应用。例如，这种多肽能够被用 来制造人工红细胞。
6.人工红细胞
许多不同的方法己经被用于红细胞替代物的开发。 一种方法涉及 全氟化碳的使用。全氟化碳乳剂包含能够结合氧并传递它至组织的 合成的氟代烃。然而，该方法增加了网状内皮细胞阻断。全氟化碳 能够在网状内皮系统中被捕捉，其可以导致不利后果。
另外一种方法关注于抗原伪装，其涉及使用被称为聚乙二醇
(PEG)的生物相容性聚合物来包裹红细胞。PEG分子在所述细胞表
面形成永久的共价键，以便血液受体的抗体不将所述细胞识别为异
质的。例如，具有A型血液的正常人的免疫系统将天然地具有识别B 型红细胞表面抗原的抗体，导致细胞破坏。PEG与B型红细胞表面的 连接\"伪装\"了细胞的表面，以便它的表面抗原不能再被免疫系统识 别且抗原性的异质红细胞将不会被迅速摧毁(参见Pargaonkar， N.A. ， G. Sharma和K. K. Vistakula. (2001) \"Artificial Blood: Current Research R印ort〃，其由此通过引用被整体并入本文)。
包括珠蛋白生成障碍性贫血在内的需要重复的血液输入的许多 疾病常常并发于针对\"较小\"红细胞抗原的抗体的发風该\"同种致敏\" 能够致使这些患者几乎不可能输血，致使威胁生命的境地。在体外 测试中，PEG修饰的红细胞表现出不触发同种致敏并还可能有用于同 种致敏已经发生的临床表现(见Scott， M.D.等人(1997) \"Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes, 〃尸roc 7fe〃. ^cad 5bZ USA. 94 (14) : 7566—7571， 其由此通过引用整体并入本文)。
其他方法涉及纯化的血红蛋白。未经修饰的无细胞的血红蛋白具 有已知的局限性。这些包括对于有效的组织氧合作用而言过高的氧 亲和力、对于临床有效而言过短的血管内腔中的半衰期和经历结果 为肾脏管状损伤和毒性的分解成二聚体的趋势。因为这些局限性， 被用来制备无细胞的红细胞替代物的血红蛋白必须被修饰。许多修 饰技术已经被开发。血红蛋白能够使用如戊二醛的试剂被交联(通 过化学修饰形成两个分子间的共价键)并聚合。这种修饰导致P5。(所 有氧合位点的50%被占有时的氧分压)比正常血红蛋白高的产物并增 加血浆半衰期至30小时。用于此目的的血红蛋白的来源可以是人类 (过时的捐赠血液)、牛或人类重组体。经修饰的血红蛋白的溶液 从高度纯化的血红蛋白制备并通过各种生化过程提取以清除磷脂、 内毒素和病毒污染物(见Nester， T.和Simpson, M (2000) 〃Transfusion medicine update, 〃 WJoc^ 6^Z s^z.tt/z^51， 其由]t匕通过引用整体并入本文)。Biopure公司(Cambridge, MA)己经使用修饰 的血红蛋白用于他们的产品Hemopure。
修饰的血红蛋白溶液的主要的潜在不良作用是全身和肺循环血 管阻力的增加，其可以导致心脏指数的降低。心脏指数的降低可以 损害最佳的氧传递并超过氧运送溶液的优点(见Kasper S. M.等人. (1998) 〃The effects of increased doses of bovine hemoglobin on hemodynamics and oxygen transport in patients undergoing preoperative hemodilution for elective abdominal aortic surgery, 〃 細化87: 284-91 ，其由此通过引用整体并
入本文)。 一项研究已经检验了这些溶液在不稳定床上患者的急性复 苏相中的效用。然而，研究的设计是差的，且溶液在影响最终患者 结果中的任何作用是不清楚的(见Koenigsberg D.等人.(1999) \"The efficacy trial of diaspirin cross-linked hemoglobin in the treatment of severe traumatic hemorrhagic shock, 〃 Jcsd ^77e2^. #ed 6: 379-80，其由此通过引用整体并入本文)。
无细胞的血红蛋白的许多问题可以通过使用人工膜包裹它而被 克服。脂质体正在被用来包裹作为血液替代物而使用的血红蛋白。 该方法在技术上是具挑战性的，因为不仅必须血红蛋白被制备，而 且它必须以相对高的浓度和收率被包裹。最终产物必须是无菌的并 且脂质体必须在尺寸上相对均一。
包裹的血红蛋白比无细胞的血红蛋白具有几个优点。首先，人工 细胞膜保护血红蛋白免受血浆中的降解和氧化力。第二，所述膜保 护脉管内皮免受血红蛋白的毒性作用。这些作用涉及亚铁血红素的 丢失、02游离基的生成和恥结合的血管收缩作用。第三，包裹大大 增加了血红蛋白的循环持续性。而且，包裹的血红蛋白能够被冷冻 千燥用于方便储存。
脂质体包裹涉及磷脂，如在细胞膜中的磷脂。然而与脂质体包裹 相关的一个主要问题是很难调节脂质体的平均尺寸和分布。另一个 问题是不像红细胞，脂质体通常是非常不稳定的，由于他们通常缺 乏有组织的细胞骨架。而另外一个问题是脂质体通常由磷脂的多层
组成(近期关于血液替代物发展的综述出现于Stowell等人(2001) Progress in the development of RBC substitutes, 7hm9/l/57\'o/ 41:287-299，其由此通过引用整体并入本文。还参见Chang, T. 1998 \"Modified hemoglobin- based blood substitutes: cross linked, recombinant and encapsulated hemoglobin\" ， Arti/!z\'\"\'a2 /J 5Y//^2 2:233-41,其由此通过引用整体并入本文)。
采用了使用本发明方法设计的多肽的红细胞替代物相对于现有 技术中已知的红细胞替代物开发方法应提供几个优点，包括但不限 于优良的氧和二氧化碳结合功能性、较低的生产成本(大规模并因 此低成本的生产是可能的，因为细菌可以被用来大量生产肽并因为 肽ELBL能够被自动化)、使用适当的血红蛋白制备方法作为ELBL 模板的可能性、多肽的生物可降解性、基于血液蛋白结构的设计的 多肽的免疫\"惰性\"和设计的多肽薄膜所展现的超越脂质体的结构稳 定性。多肽ELBL组装生成了半多孔薄膜，最小化了形成包裹方法和 使葡萄糖、氧、二氧化碳和各种代谢产物能够通过作为脂双层的薄 膜自由扩散所需的材料量。相反，可能适合此目的的其他聚合物具 有不想要的不良作用一例如，多乳酸化合物降解成乳酸、导致肌肉 痛性痉挛的物质和聚(苯乙烯磺酸)不是生物相容性的。
微囊可以由设计的多肽制造以包括血红蛋白来作为红细胞替代 物。血红蛋白多肽微囊还可以被设计以包括酶，包括通常对红细胞 功能是重要的超氧化物岐化酶、催化酶和高铁血红蛋白还原酶。而 且，纳米加工的微囊可以被预测性地脱水，表明如这里描述制成的 人工红细胞可以被脱水而无功能损失，特别因为血红蛋白可以被低 压冻干(即冷冻干燥)并被重新溶解而无功能损失，且聚离子薄膜 对于脱水作用是稳定的。这对长期储存、血液替代物运输、战场应 用(特别是在远的地方)和空间探索是重要的。
使用本发明方法设计的多肽还能用于药物传输。
7.药物传输
\"晶体\"形式的适当的治疗性物质的微米大小的\"核心\"可以被设 计的多肽包裹，生成的微囊可以用于药物传输。所述核心必须在某
些条件下(例如高PH或低温)是不溶的并在某些条件下(其中将出 现控制释放)是可溶的。晶体上的表面电荷可以通过；电势测量(用 于测定液体介质中胶体颗粒上静电单元中的电荷)来测定。微囊内 含物从微囊内部释放至外周环境的速率将取决于许多因素，包括包 裹外壳的厚度、外壳中使用的多肽、二硫键的存在、肽的交联程度、 温度、离子强度和用来组装肽的方法。通常，胶囊越厚，释放时间 越长一原理类似于凝胶过滤色谱。
己经做了一些关于从ELBL微囊缓释释放的工作(见Antipov， A.， Sukhorukov， G, B. ， Donath， E.和Miihwald， H. (2001) /C/ e瓜 B， 105:2281—2284和Freemantle, M. (2002) Polyelectrolyte multilayers, C力e瓜Ay^. 7\\fe^， 80: 44-48，两者在这里通过引用 整体并入本文)。已经被使用的聚电解质是PSS、 PAH、 PAA、 PVS、 PEI 和PDM。
使用本发明方法设计的多肽应该提供许多有关药物传输方面的 优点，包括但不限于对微囊的物理、化学和生物学特征的控制； 制备直径小于lmm的胶囊的能力，使胶囊适合于注射；引发免疫应 答的低的可能性；胶囊的普遍高的生物相容性；如下所述通过改变 所述层的厚度和使用半胱氨酸对微囊扩散性质的控制；通过使用半 胱氨酸(如现有技术中已知的，游离巯基基团、游离氨基基团和游 离羧基基团是用于特异性靶向的分子可以被连接的位点)中高反应 性的巯基基团修饰微囊表面或者通过在多肽设计中包括特异功能性 结构域来耙向特定位点的能力；和微囊被细胞利用内吞或胞饮而吸 收的能力。
使用本发明方法设计的多肽还能用于抗微生物涂层。 8.抗微生物涂层
本发明的方法能够用来生产包括抗微生物肽的薄膜。例如， 一种 适当的序列可以是存在于人类中的富组蛋白5:
Asp Ser His:Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr (SEQ ID NO: 8)。
在弱碱性pH下的正电荷优势使该序列非常适合于ELBL。它可以 附加至使用本发明方法设计的肽，产生适合于在ELBL中使用的抗微 生物肽。该肽能够被用作抗生物污垢涂层。例如，所述肽能够被用 来在用于植入的装置上形成涂层。
使用本发明方法设计的多肽还能在许多其他领域应用。
9.其他用途
关于使用本发明方法设计的肽的其他可能的用途包括但不限于 食品盖、包装和分离层；食品箱、包、袋和标签；食品涂层；食品 成分微囊；药物涂层、胶囊和微囊； 一次性食品供给商品(盘子、 杯子、刀叉餐具)；垃圾袋；用于肥料和杀虫剂的水溶性袋；用于 肥料和杀虫剂的微囊；农业覆盖物；纸涂层；释放-充填包装； 一次 性医疗产品难(如手套和大衣)；和一次性尿布。
B.制造
一旦氨基酸序列基序已经从使用上面(A) (1)部分讨论的方法所 识别的序列基序被选择或者被重新设计，则使用现有技术中已知的 方法合成所设计的多肽，如使用固相合成和F-moc化学或异源表达 基因克隆和转化。设计的多肽可以由肽合成公司(例如SynP印公司 (Dublin, California))合成，或者使用肽合成仪在实验室生成， 或者通过重组方法生成。
在一个实施方案中，设计的多肽(例如，第一层多肽)包含多个 随机结合生成一个多肽链的单个氨基酸序列基序。在设计用于ELBL 的多肽中，同样的基序可以被重复，或者不同的基序可以被连接。 而且，如上所述，可以包括功能性结构域。氨基酸例如甘氨酸或脯 基酸可以被用来连接序列基序，以便保持多肽的整体电荷性质，艮P， 多肽上每个残基的净电荷强度为0.4。在一个实施方案中，连接体包 含l-4个氨基酸残基，例如卜4甘氨酸或脯氨酸残基。另外，不同 于20种普通氨基酸的氨基酸可以被包括在基序本身中，取决于多肽 所需要的性质。使用现有技术中已知的方法，其他性质同样可以由 设计要求所指定。例如，脯氨酸可以被包括用于转角形成，甘氨酸 用于链灵活性，和组氨酸用于在接近中性pH下的pH敏感的电荷性
质。\"疏水性的\"氨基酸也可以被包括一疏水性残基内含物能够在组 装行为中起作用并通过类似球形蛋白的疏水稳定化的方式促进层的 稳定性。
在一个实施方案中，第一层多肽包含一个或多个氨基酸序列基 序，其中所述多肽长度为至少15个氨基酸，并且在pH 7.0下，相 同符号荷电残基的数目减去相反符号的残基数目，与多肽总残基数
目的比值大于或等于0.4。换言之，多肽上每个残基的净电荷强度大 于或等于0.4。在另一实施方案中，在pH 7.0下，相同符号荷电残 基的数目减去相反符号的残基数目，与多肽总残基数目的比值大于 或等于0. 5。换言么多肽上每个残基的净电荷强度大于或等于0. 5。
在一个实施方案中，设计的多肽长度大于或等于15个氨基酸， 在其他实施方案中，设计的多肽长度大于18， 20， 25， 30， 32或35 个氨基酸。此原因是，每分子的熵损失对于短聚合物来说是如此在 热力学上不利的，以至于对荷相反电荷的表面的吸附被抑制，即使 多肽具有每单位长度1个电荷；长的聚电解质比短的吸附更好。这 在图12中有所描述。被用于长度依赖性研究的肽的平均分子量是 1500-3000 Da (聚L-谷氨酸， 〃小的〃)、3800 Da (聚L-赖氨酸，〃 小的〃)、17000 Da(聚L-谷氨酸， 〃中的〃)、48100 Da (聚L-赖氨酸， 〃中的〃)、50300 Da (聚L-谷氨酸， 〃大的〃)和222400 Da (聚L-赖 氨酸， 〃大的〃)。图12中显示的数据清楚表明ELBL依赖肽的长度。 Cys的加入使相对小的肽能够用于ELBL，因为巯基基团能够被用来 在多肽间形成二硫化物交联。
C.薄膜组装
制备设计多肽多层膜的方法包括在模板上沉积多层带相反电荷 的化学物质，其中至少一层包含设计的多肽。成功沉积的聚电解质 将具有相反的净电荷。在一个实施方案中，设计多肽(或其他聚电 解质)的沉积包括在下述pH下使基质暴露于包含设计多肽(或其他 聚电解质)的水溶液其具有适合于ELBL的净电荷。在其他实施方 案中，设计多肽或其他聚电解质在基质上的沉积通过相继喷雾带相
反电荷的多肽溶液而实现。在其他实施方案中，在基质上的沉积通 过同时喷雾带相反电荷的聚电解质溶液而实现。
在生成多层膜的ELBL方法中，相邻层的相反电荷与抗衡离子释 放至溶液后的熵增加， 一起提供了组装的驱动力。相对层中聚电解 质具有相同净线性电荷密度不是关键的，而只要相对层具有相反电
荷。标准的膜组装过程包括在聚离子为离子化的pH(即，pH4-10)
下生成聚离子水溶液，提供带有表面电荷的基质，和将基质交替浸 入带电聚电解质溶液。基质任选在交替层沉积之间被洗涤。 本领域普通技术人员容易确定适合沉积聚离子的聚离子浓度。示
例性浓度为0. 1至10 mg/mL。通常，产生的层厚度基本上与沉积过 程中处于上述范围内的聚离子溶液浓度无关。对于典型的非肽聚电 解质例如聚丙烯酸和聚(盐酸丙烯胺)，通常的层厚度为约3至约 5A，取决于溶液的离子强度。短聚电解质通常形成比长聚电解质更 薄的层。对于薄膜厚度，聚电解质薄膜厚度取决于湿度以及层数和 薄膜组成。例如，50 nm厚的PLL/PLGA薄膜在氮干燥后收缩至1. 6 nm，通常，可以形成1-2 nm至100 nm或更大厚度的薄膜，取决于 薄膜的水合状态和组装中采用的聚电解质分子量。
另外，形成稳定的聚电解质多层膜所需要的层数将取决于薄膜中 的聚电解质。对于仅含有低分子量多肽层的薄膜，薄膜通常具有4 个或更多个带相反电荷的多肽双层。对于含有高分子量聚电解质例 如聚丙烯酸和聚(盐酸丙烯胺)的薄膜，包含一个带相反电荷的聚 电解质双层的薄膜可以是稳定的。
D.实验
1.实例1 一基于人类血液蛋白序列的多肽的设计以及它们在 多肽薄膜制造中的应用
为此工作，使用上面(A) (l)部分中描述的方法选择氨基酸序列以 识别人类血液蛋白的一级结构中的序列基序补体C3 (gi|68766) 是阴离子序列基序的来源，而乳铁传递蛋白(gi 14505043)是阳性序 列基序的来源。如上所讨论的，血液蛋白序列被用来最小化涉及所 述多肽的装置(包括，例如人工红细胞)可能被引入其中的患者的免
疫应答。原则上，该方法应该可应用于任何具有免疫系统的生物体；
它不限于人类。多肽由SynP印公司(Dublin, California)合成。所 述多肽序列为
TyrGluGluAspGluCys Gin Asp Gly Glu Glu AspGlu Cys
GinAspGlyGluGluAsp Glu Cys Gin Asp Gly GluGlu Asp
GluCysGinAsp
(SEQ ID NO: 2)
TyrArgArgArgArgSer Val Gin Gly Arg Arg ArgArg Ser
ValGinGlyArgArgArg Arg Ser Val Gin Gly ArgArg Arg
ArgSerValGin
(SEQ ID NO: 1)
TyrGluGluAspGluCys Gin Asp Gly Glu Glu AspGlu Cys
GinAspGlyGluGluAsp Glu Cys Gin Asp Gly GluGlu Asp
GluCysGinAspGlyGlu Glu Asp Glu Cys Gin AspGly Glu
GluAspGluCysGinAsp
(SEQ ID NO: 4)
TyrArgArgArgArgSer Val Gin Gly Arg Arg ArgArg Ser
ValGinGlyArgArgArg Arg Ser Val Gin Gly ArgArg Arg
ArgSerValGinGlyArg Arg Arg Arg Ser Val GinGly Arg
ArgArgArgSerValGin
(SEQ ID NO: 3)
氨基酸残基由上述给定的三字母表示。 一个甘氮酸在各7残基基 序之间被引入以抑制二级结构的形成。甘氨酸被选择用于此目的， 因为它允许在双面角的结合中最大的可变性(见Ramachandran， G.N. 禾口 Saisekharan， V. (1968)， A/r.尸rotej77 23:283，其
通过引用整体并入本文)并具有低螺旋倾向性(0. 677)和低折叠倾向
性(0.766)。或者，根据计算的结构倾向性脯氨酸可以取代基序间的 甘氨酸。另外，单个酪氨酸被包括在每个肽的N末端用于通过浓度 测定，通过在280nm处的UV吸收。SEQ ID N0:2在pH 7时的净电荷 强度为20/32 (0. 625); SEQ ID N0:1的净电荷强度为16/32 (0. 5); SEQ IDN0:4在pH7时的净电荷强度为30/48 (0.625);而SEQ IDN0:3 在pH 7时的净电荷强度为24/48 (0.5)。在所有情况中，pH7时的
净电荷强度大于或等于约第一层多肽总长度的1/2。
多肽被分别命名为SN1(SEQ ID NO: 2)、 SP2 (SEQ ID NO: 1)、 LN3(SEQ ID NO: 4)和LP4 (SEQ ID NO: 3)，表示短阴性、短阳性、 长阴性和长阳性。这些序列非常不同于聚赖氨酸(一般在现有技术 中作为聚阳离子使用)和聚谷氨酸(一般在现有技术中作为聚阴离 子使用)，尽管其可商业获得且不昂贵，但其在温和PH的条件下具 有高度a-螺旋倾向性且重要的是免疫反应性的。在中性pH下，设计 的肽上计算的每单位长度的电荷对于SP和LP是0. 5静电单位以及 对于SN和LN是0. 6静电单位。阳性肽在某种程度上比阴性肽更具 疏水性，归因于缬氨酸和精氨酸侧链长烃的存在(如上所述，多肽 层间的疏水性相互作用能够稳定薄膜至一定程度)。所述长度与己 公开的研究一致，表明聚离子必须有大于20的荷电基团(即天冬氨 酸和谷氨酸；赖氨酸、精氨酸和组氨酸)以适合于ELBL(见K油anov， V.禾口Zezin， A. (1984)尸wr^4; p丄C/ e瓜56:343禾口 Kabanov， V. (1994)尸o^f瓜36: 143，两者在这里通过引用整体并入本文)。 a.实验说明 i.材料
镀银的QCM电极(USI-System, Japan)具有在每侧上的表面积 0.16 士 0.01 cm2、共振频率9 MHz (AT-cut)和长期稳定性土2 Hz。 通过电喷射质谱证实了多肽分子量。肽纯度大于70 %。多肽缓冲液 为10 mM磷酸钠或10 mM Tris-HC1， 1 mM DTT， 0. 1 mM叠氮化钠，pH 7.4。所有不同于多肽的化学物质均购自Sigma-Aldrich (USA)。
ii. 方法
使用成对的设计的多肽(一个阴性， 一个阳性)进行实验。使用
标准ELBL技术将由至少5个如上识别的SP2、 SN1、 LP4和LN3双层 所组成的多层薄膜沉积在QCM共振器上(双层由一层多聚阳离子和 一层多聚阴离子组成)。用于层吸附的多肽浓度是2 mg-mL—、已知 聚离子层的厚度对聚电解质浓度的依赖性不强(见Lvov, Y.和 Decher， G. (1994) Crj^^3^og 39:628，其在这里通过引用
整体并入本文)；在0.1-5 mg-mL—\'的浓度范围内，双层厚度近乎独 立于用于PSS/PAH的浓度。相反，多肽薄膜显得比那些使用高分子 量PSS/PAH(使用利用已知的Sauerbrey方程的A/数据计算的质量) 制造的薄膜厚度小很多；见Lvov, Y.和Decher，G. (1994) Cry\"aU^\". 39:628。这紧随根据沉积的质量计算薄膜厚度，
如在现有技术中通常对蛋白质所进行的。图3(c)中显示的为设计的 多肽组装所计算的厚度大于用于制造薄膜的肽的点对点长度。。DTT 以lmM被包括以抑制二硫键的形成。吸附时间为20分种。
在后续吸附循环之间共振器在纯水中被冲洗1分种(去除大约 10-15%的弱吸附物质)并在N2气流中干燥。然后，通过QCM直接测
量沉积肽的质量。质量测量包括一些水(尽管干燥)和低质量离子 如K+、 Na+和C1—。肽的相邻层的部分相互渗透是很可能的(见Decher， G. (1997) 6\"\".e騰227:1232; Schmitt等人(1993)船cr,JecWes 26:7058;和Korneev等人.(1995)尸力j^ \'ca万214:954);这对二硫 键\"锁定\"效率可能是重要的。
iii. 结果
在多肽吸附以及冲洗和干燥QCM共振器之后，测定共振器的共振 频率。这实现了在吸附上的频率转换和在吸附质量中的变化的计 算。频率的降低表明吸附质量的增加。结果在图3 (a)和3 (b)中被 提供。图3 (a)显示了在不同缓冲液(10mM磷酸钠，pH 7. 4， 1 mM DTT 和10 mM Tris-HC1, pH 7. 4， 1 mM DTT)中对LP4和LN3的吸附数据 的比较。根据这些数据，显然吸附数据更依赖于肽的性质而非使用 的缓冲液的特定性质。图3(b)显示了SP2、 SN1、 LP4和LN3的不同
组合(即SP2/SN1、 SP2/LN3、 LP4/SN1和LP4/LN3)在10mM磷酸钠(pH 7. 4和1 mM DTT)中的共振器频率与吸收层(线只连接实验数据点)。 如ELBL所要求的，这些组合的每一个都包括一个阳性多肽和一个阴 性多肽。图3(c)显示了 SN1和LP4在10 mM Tris-HCl (pH 7. 4和1 mM DTT)中计算的吸附质量与层数的图(使用Sauerbrey方程从实 验数据计算的)。总吸附质量(约5吗)大致相当于l mnol的肽。 用于此计算的方程是Am二一0.87，10—9A/，其中m是质量克，/是频 率Hz (见Lvov, Y. ， Ariga， K. ， Ichinose， L，和Kunitake, T. (1995) j瓜O e瓜5bc. 117:6117和Sauerbrey， G. (1959) Z尸A7幻A 155:206，两者在这里通过引用并入本文)。薄膜厚度d被估计为d = —0.016A/， 其中d是nm(见Yuri Lvov, \"Electrostatic Layer—by—Layer Assembly of Proteins and Polyions〃 in尸ro力ei/ Arc力itect\"re: i\"z ter/acj\'a2 /J/cJecwJar 爿5^e/aW7 朋c/ /腳Z^^\"。\"肠tec力/7c^o^j， (Y. Lvov H. Miihwald编辑，2000) (New York: Dekker， 2000) pp. 125-167，其通过引用并入本文)。 图3(c)中的线是对实验数据点的线性匹配。数据的线性是吸附过程
中精确规则的组装以及各吸附层中多肽大致均一密度的合适的指 标。吸附伴随一610 ± 60 Hz (阳离子)或一380 ± 40 Hz (阴离子)
的频移而发生。沉积多肽质量的线性增长表明组装过程中初期吸附 步骤的重复和多层制造过程的普遍成功。 iv.结论
以上结果显示使用本发明方法设计的多肽适合于ELBL，不管来 自PSS和PAH显著的定性差别，灵活的同聚物在pH 7. 4下每单位长 度具有1个电荷。聚L-赖氨酸和聚L-谷氨酸上每单位长度的电荷在 pH 7. 4下为1，如PSS和PAH具有的，但这些多肽在各种条件下都 具有显著的形成a-螺旋结果的倾向，使它们在需要对薄膜结构进行 控制时明显不适合于多层组装。然而，本发明的单分散的多肽使实 施者能够非常精确地知道正在被用于ELBL的材料的结构。而且，聚 L-赖氨酸、聚L-谷氨酸、PSS和PAH的普通商业制剂在人类中引起 免疫应答(即，是免疫原性的)。
因为如实验所证明的，设计的多肽容易被吸附在相反电荷的表面 之上，所以没有对\"前体\"层的需求。如现有技术已知的，\"前体\"层被 沉积在基质上以提高弱吸附性物质的吸附。前体层的缺乏提高了聚 离子薄膜的生物相容性(因为通常作为前体使用的聚合物是免疫原 性的)或允许比设计的多肽更低精确的对聚合物结构或薄膜结构的 控制。
设计的多肽的多层在人类血液pH (7.4)下是稳定的。因此，所 述多层应该有用于广泛的生物学应用。设计的多肽(每个多肽的每 个残基少于1个电荷)的吸附在2 mg/mL和低离子强度下基本在少 于10分种之内完成。这意味着这些多肽能够被用来快速并相对容易 地形成多层薄膜。在各层沉积之后使用N2 w干燥所述肽薄膜没有影 响组装。干燥的进行是为了得到准确的QCM频率测量，但不是组装 所需要的。
薄膜组装实验在比血液低的离子强度下完成但该过程产生与在 较高离子强度下性质上类似的结果。主要的差别每个吸附层沉积的 肽的量一离子强度越高，沉积的肽的量越大。这由图7中的图所描 述，其显示了沉积的物质的量作为离子强度的函数一所使用的肽是 聚L-谷氨酸和聚L-赖氨酸。QCM共振频率是针对吸附层标绘的。聚 L-谷氨酸的平均分子量是84600 Da，而聚L-赖氨酸的平均分子量是 84000 Da。用于组装的肽浓度是2 mg/mL。数据表明盐浓度(溶液的 离子强度)影响了薄膜组装。通常，每层沉积的物质的量随0-100mM NaCl范围内的离子强度而增加。由于在相对高的每单位长度净电荷 和低离子强度条件下使用设计的多肽的ELBL的基本特征似乎不依赖 于缓冲液的选择，在人类血液的离子强度下预期有在性质上的类似 结果。因此，缓冲液的选择应该不根本改变多层在其靶环境中的稳 定性。然而，即使缓冲的选择不影响多层的稳定性，\"锁定\"机制作 为稳定胶囊的设计特征将是可获得的。
阳性多肽比阴性多肽更大明显的沉积可以产生于阳性多肽在pH 7. 4下的每单位长度的较高电荷。沉积在每层中的物质很可能符合为
中和下面的表面的电荷所需要的物质。疏水相互作用也能够帮助解 释吸附行为的这一特征。
对于蛋白质和其他聚合物的普通薄膜厚度的计算很可能对于短
多肽(计算的厚度是60-90 rnii但10个多肽的累积长度约为120 nm) 是无效的。这很可能起因于相对短的多肽在吸附表面上的包裹的高 密度；该结果也符合薄膜厚度随离子强度变化的发现，由于聚合物 的结构性质将发生变化并且经由离子的电荷筛选将减少吸附肽之间 的层内电荷斥力。这里讨论的设计的多肽薄膜的厚度被估计为20-50 nm0
设计和制造循环的许多方面能够被自动化。例如， 一种计算机算 法可以被用来优化用于ELBL的肽的一级结构，通过比较预测的肽性 质和观察到的物理性质，包括溶液中结构、吸附行为和薄膜在极端 pH下的稳定性。而且， 一旦各个步骤的细节已经被基本确定，多肽 薄膜组装过程能够被机械化。
实例2—涉及含有半胱氨酸的重新设计的多肽的实验
b.多肽
使用的多肽为
Tyr Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys\'Gys Lys Gly Lys Val Lys
(SEQ ID NO: 5)
Tyr Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu
(SEQ ID NO: 6)
不同于在这里描述的实验中使用的其他多，jt这两个不是使用人
类基因组信息设计的多肽；它们被设计的唯一目的是评价在多肽薄 膜稳定化中二硫键形成的作用。SEQ ID N0:5的在pH7时的净电荷强 度为16/32 (0.5);而SEQ ID N0:6在pH7时的净电荷强度16/32 (0.5)。在这两种情况下，pH7时的净电荷强度大于或等于约第一层 多肽总长度的1/2。
c. 操作
所有实验在室温下进行。
所有使用QCM的组装实验在相同条件下进行，除了使用空气代替 氮气来干燥即将经历氧化的样品。组装条件是10mMTris-HCl， 10 mM DTT， pH 7.4。额定的肽浓度是2mg/ml。形成的层数是14。
用于氧化样品的二硫化物锁定条件是10 raM Tris-HC1， 1% DMSO， 使用空气饱和水，PH 7.5。\"锁定\"步骤持续6小时。用于还原样品 的条件是10 mM Tris-HCl， 1 mM DTT，使用氮气饱和水，pH 7.5。 该步骤持续6小时。
所有使用QCM的分解实验在相同条件下进行，除了使用空气代替 氮气干燥氧化样品。分解条件是10 mM KC1, pH2.0。在干燥前使用 D.I.水冲洗样品30秒钟。
三个不同类型的实验被进行(1)还原一无处理在组装后立即 进行分解(2)还原一6小时，如上所述用于还原样品；和(3)氧化一6 小时，如上所述用于氧化样品。
d. 结果
结果在图10中描述。在首先的两个实验(都是还原)中，所有 的沉积物质(100 %)在50分种内分解。相反，在氧化实验中，在肽 薄膜包被的QCM共振器在pH 2下保持5小时之后大量物质保留。多 肽薄膜在酸性pH下的稳定性由组装条件决定；这样，薄膜或胶囊的 稳定性是通过使用多肽作为ELBL的聚电解质而成为可能的设计特 征。
e. 结论
静电力在一起保持电荷相反的设计的多肽层中起关键作用。在酸 性pH下，在一个肽上的净电荷被中和且多肽薄膜由于静电排斥而分 解。还原条件防止二硫键的形成。因此，层间的静电吸引是在这些 条件下用于稳定层的唯一的结合力。相反，在氧化条件下，二硫键
形成。在酸性pH下，二硫键抑制薄膜分解。结果表明酸性pH下的
层稳定性直接受层内和/或层间的二硫键的形成一即同一层中的分
子间，相邻层的分子间，或两者一的影响。这通过图io中显示的结
果被描述一由于二硫化物锁定，超过30 %的薄膜在酸性pH下保持稳 定，不管在相对低的离子强度下的静电排斥。具有更多半胱氨酸残 基的肽被期望以进一步提高二硫化物锁定效率。而且，肽组装条件 的调节将是设计具有所需物理以及化学和生物学性质的薄膜的重要 方面。
实例3—涉及含有半胱氨酸的设计的多肽的实验 f.材料
该实验的基本要素是石英晶体微量平衡仪器；镀银的共振器(9 MHz共振频率)；阴性48-残基肽(LN3) (SEQ ID NO: 4);和下述序 列的称为\"SP5\"的阳性48-残基肽
Tyr Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His
(SEQ ID NO: 7)
像上面(D) (l)部分中讨论的其他设计的月fc使用上面(D) (l)中描 述的方法设计SP5以分析人类血液蛋白乳铁传递蛋白(gi I 4505043) 的氨基酸序列。ELBL缓冲液是10 mM Tris、 pH 7.4、 10 mM NaCl 和1 mM DTT。分解缓冲液是10 mM KCl、 pH 2。通过将4mg各肽加 入2mL上述缓冲溶液并调节各溶液至pH7. 4制备SP5和LN3的2mL 肽溶液；所述肽浓度为2 mg-ML一1。
g. 用于监测多肽层在QCM共振器上组装的操作 还原操作如下(1)在肽吸附之前检测并记录共振器的频率；(2)
共振器被浸泡入SP5肽溶液中持续20分种(3)共振器被浸泡入SP5 冲洗溶液中持续30秒钟；(4)共振器从冲洗溶液中移出并使用氮气 干燥；(5)记录共振器的QCM共振频率；(6)共振器被浸入LN3肽 溶液中持续20分种；(7)共振器被浸入LN3冲洗溶液中持续30秒 钟；(8)共振器1从冲洗溶液中移出并使用氮气干燥；(9)记录共 振器的QCM共振频率；(10)重复步骤2至9直至16层被吸附至共 振器上。
氧化操作与还原操作相同，除了共振器在D. I.水而非SP5缓冲 液或LN3缓冲液中冲洗，且在每次测量前使用空气代替氮气干燥。
h. 锁定操作
还原操作如下共振器被至于含有1 mM DTT的水溶液中持续6 小时。DTT， 一种还原剂，抑制了二硫键的形成。
氧化操作如下共振器被至于空气饱和的含有1 % DMSO的水溶 液中持续6小时。匿SO， 一种氧化剂，促进了二硫键的形成。
i. 共振器上的分解
i. 溶液
还原条件如下10 mM KC1， 1 mM DTT， pH 2。 氧化条件如下10 mM KC1， 20% DMSO， pH 2。
ii. 用于分解的操作
还原操作如下(1)通过QCM测定并记录共振器的初始共振频 率；(2)共振器被浸泡入还原分解溶液5分种；(3)共振器在还原 缓冲溶液中冲洗30秒钟；(4)共振器使用氮气干燥；(5)通过QCM 测定并记录共振器的共振频率；(6)重复步骤2至5用于在5、 10、 15、 20、 30、 60和90分种的时间读数。
氧化操作与还原操作相同除了共振器的冲洗在空气饱和的D. L 水而非还原缓冲液中进行。
丄结果
图8显示了在SP5和LN3的薄膜组装过程中沉积的大致线性的质 量增加。两个共振器都显示了在组装过程中几乎相同的质量沉积， 不论组装条件的差异。
图9显示薄膜组装过程中保留的材料的比例。经受氧化条件的层 在酸性pH下显示了最小的材料损失，有接近90-95%的质量保留。相 反，经受还原条件的层在暴露于酸性pH的前5分种之内损失了接近 全部的胞膜材料。
k.结论
结果表明，在酸性pH下，二硫键防止了层退化并保持层牢固地 在一起。在酸性pH下的层稳定性直接受层内和/或层间二硫键的形 成的影响。二硫键形成依赖于相互间半胱氨酸残基的浓度和亲近。 增加多肽每单位链长的浓度将因此直接影响二硫键的形成和薄膜稳 定性。增加用于薄膜组装的缓冲溶液的离子强度通过增加每吸附循 环的沉积物质的量和每层的厚度来影响薄膜中的半胱氨酸浓度。单 层中增加的半胱氨酸数目将以该方式增加形成的二硫键的数目并经 氧化增加薄膜稳定性。
实例4.包含RGD功能结构域的多肽薄膜，其中每个残基的线性 电荷密度强度约0.75。
在一个实施方案中，复合多肽的功能区是RGD序列，其中复合肽 的电荷密度约0. 75。 RGD序列结合受体蛋白整联蛋白的细胞外部分， 由此促进细胞粘附。样品肽设计如下
KKKAKKKGKKKAKKKGRGDKKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 8) EEEAEEEGEEEAEEEGRGDEEEAEEEGEEEAEEEY (SE0 ID NO: 9)
在该实例中，多肽SEQ ID NO: 8是带正电荷的多肽，具有RGD 功能区、第一表面吸附区KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 10)和第 二表面吸附区KKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 11)。该复合肽在pH7 下的净电荷强度/残基为+26/35或+0. 74。多肽SEQ ID NO: 9是带负
电荷的多肽，具有RGD功能区、第一表面吸附区EEEAEEEGEEEAEEEG (SEQ ID NO: 12)和第二表面吸附区EEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO: 13)。该复合肽在pH7下的净电荷强度/残基为—26/35或一O. 74。
已经合成了各种含有RGD序列的St并且研究了它们对多层膜组 装的适应性。还研究了多肽多层膜中包括RGD序列对不同哺乳动物 细胞连接和繁殖的影响。包含5个(阳性序列)和(阴性序列)双 层的多层膜沉积在石英板上。用于层吸附的复合多肽在PH7水溶液 中的浓度为2mg-ml/、吸附时间为20分钟。石英板在随后吸附循环 之间用纯水冲洗，以除去弱结合物质。在每层吸附之后，用于薄膜 组装的基质以N2气流干燥。然后，通过UV分光光度法测量沉积肽的 光学质量。图16比较了用于制备多层膜的肽中包括RGD对细胞繁殖 的影响。该技术可能用于为再生药物的长期目的的体外细胞和组织 培养。
实例5:包含RGD功能结构域的多肽薄膜，其中每个残基的线性 电荷密度强度约0. 4。
在一个实施方案中，复合多肽的功能区包含RGD序列，其中复合 肽的电荷密度约 0.4。样品肽设计如下
AAKAKAKGKAKAKAKGRGDKAKAKAKG薩AKAAY (SEQ ID NO: 14) AAEAEAEGEAEAEAKGRGDKAEAEAEGEAEAEAAY (SEQ ID NO: 15)
在该实例中，多肽SEQ ID NO: 14是带正电荷的多肽，具有RGD 功能区、第一表面吸附区AAKAKAKGKAKAKAKG (SEQ ID NO: 16)和第 二表面吸附区KAKAKAKGKAKAKAAY (SEQ ID NO: 17)。该复合肽在中 性pH下的净电荷强度/残基为+14/35或+0.4。多肽SEQ ID M): 15 是带负电荷的多肽，具有RGD功能区、第一表面吸附区AAEAE AEGE AEAEAEG (SEQ ID NO: 18)和第二表面吸附区EAEAEAEGE八EAEAAY (SEQ ID NO: 19)。该复合肽在pH7下的净电荷强度/残基为-14/35或-0. 4
要注意，复合肽的净电荷强度/残基可以通过改变表面吸附区和 功能区的结构来测定。在本实例中，前述实例的复合肽的净电荷通 过改变仅表面吸附区的结构来改变。原则上，可以使用相同的方法 来控制任何复合肽的净电荷强度/残基。但是，该方法中，表面吸附 区和功能区都应该独立适合使复合肽为可溶性的。
实例6:其中功能区包含两个功能结构域的复合肽，其中存在N 末端的表面吸附区和C末端的功能区。
在该实例中，功能结构域是Src同源区2(SH2)结构域(例如来 自人张力蛋白)和磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域(例如来自人张力蛋 白)。这些结构域结合在酪氨酸上磷酸化的特定蛋白。整合了人张 力蛋白指定结构域的复合肽的实例如下
KKXAKKXGKKXAKKKGKYWYKPEISREQAIALLKDQEPGAFIIRDSHSFRGAYGLA MKVSSPPPTIMQQNKKGDMTHELVRHFLIETGPRGVKLKGCPNEPNFGSLSALVYQH SIIPLALPCKLVIKYWYKPEISREQAIALLKDQEPGAFI工RDSHSFRGAYGLAMKVSSP PPTIMQQNKKGDMTHELVRHFLIETGPRGVKLKGCPNEPNFGSLSALVYQHSIIPLALP CKLVIKXKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO:20)
SEQ ID N0:10和SEQ ID NO: 11中的表面吸附区相同。SH2结构 域和PTB结构域序列可从National Center for Biotechnology Information访问NP—072174:
SH2 = KYWYKPEISR EQAIALLKDQ EPGAFIIRDS HSFRGAYGLA MKVSSPPPTI MQQNKKGDMT HELVRHFLIE TGPRGVKLKG CPNEPNFGSL SALVYQHS工工 PLALPCKLVI (SEQ ID NO: 21)
PTB = VLFVNSVDME SLTGPQAISK ATSETLAADP TPAATIVHFK VSAQGITLTD NQRKLFFRRH YPLNTVTFCD LDPQERK丽K TEGGAPAKLF GFVARKQGST TDNACHLFAE LDPNQPASAI VNFVSKVMLN AGQKR (SEQ ID NO:22)
我们已经合成了对应于人张力蛋白SH2结构域的基因和对应于 人张力蛋白PTB结构域的基因，并将所述基因克隆入细菌宿主，过 表达所述基因，纯化重组蛋白，表征所述结构域的各种物理性质。 在一个实施方案中，包含5个指定生物活性肽和聚(L-谷氨酸)双 层的多层膜沉积在硅晶片上用于表面鉴定，并沉积在石英板上用于 监测薄膜组装。用于层吸附的多肽在pH7水溶液中的浓度为2 mg-ML—\'。吸附时间为20分钟。基质在随后吸附循环之间用水冲洗1 分钟，以除去弱结合的物质。在每层吸附之后，基质用N2气流干燥。 然后，通过UV分光光度法测量石英上沉积的肽的光学质量，并通过 原子力显微镜检查法鉴定硅晶片上薄膜的表面形态。该技术可能用 于为再生药物的长期目的的体外细胞和组织培养。SH2结构域整合入 本文所定义的生物活性肽，能够使多层膜与磷酸酪氨酸肽结合。该 技术可能用于诊断目的。
实例7:在多肽N末端包含一个功能区和一个表面吸附区的复合 多肽
该实例中，功能区是已知的蛋白质功能结构域，例如人辅助蛋白 的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)结构域
KKKAKKKGKKKAKKKGLKDTLKDTSSRVIQSVTSYTKGDLDFTYVTSRITVMSFPLD NVDIGFRNQVDDIRSFLDSRHLDHYTVYNLSPKSYRTAKFHSRVSECSWPIRQAPSLH NLFAVCR丽Y丽LLQNPKNVCWHCLDGRAASSILVGAMFIFCNLYSTPGPAIRLL YAKRPGIGLSPSHRYLGYMCDLLA (SEQ ID NO:23)
表面吸附区与SEQ ID NO\'. 10相同。PTP结构域的序列可获自 National Center for Biotechnology Information, 访问号075061: PTP结构域
LKDTLKDTSSRVIQSVTSYTKGDLDFTYVTSRIIVMSFPLDNVDIGFRNQVDDIRSFLD SRHLDHYTVYNLSPKSYRTAKFHSRVSECSWPIRQAPSLHNLFAVCR應YNWLLQN
YMCDLLA (SEQ ID NO:24)
实例8:包含两个功能区的复合多肽，其中存在三个表面吸附 区， 一个在复合肽的N末端， 一个在C末端，还一个在两个功能区 之间，并且其中存在两个不同的糖基化功能区。
代表性的肽结构如下
SAR-功能区-SAR-功能区-SAR
其中，如前，SAR是基序并因此适合表面吸附例如RRRARRR (SEQ 工DN0:25)， 一个功能区含有N联糖基化的识别位点，例如GGNVSGG (SEQ ID N0:26)，另一功能区含有0联糖基化的识别位点，例如 PPSSSPP (SEQ TD N0:27)。
代表性复合肽的氨基酸序列为
RRRARRRGGNVSGGRRRARRRPPSSSPPRRRARRR (SEQ ID NO:28)
复合多肽在pH7时的净电荷强度/残基为+18/35^+0.5。这种情 况下的多层膜由指定的阳性肽和适当的阴性肽构成，例如
EEEAEEEGEEEAEEEGEEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO:29)
实例9:具有一个功能区的复合肽，其中复合肽C末端存在一个 表面吸附区，并且其中存在包含己知具有抗微生物活性的肽序列的 一个功能区。
代表性肽结构如下
功能区-SAR，其中如前，SAR是适当的表面吸附区，例如 KKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ID NO: 11)，并且该功能区含有富组蛋白5 的序列，即，DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY(SEQ ID NO: 30)。代表性 复合肽的氨基酸序列为
RRRARRRGGNVSGGRRRARRRPPSSSPPRRRARRR (SEQ工D NO:31)
该代表性复合肽在pH 5.5时的净电荷强度/残基为+24/39 二 +0.6。该例中的多层膜由指定的阳性肽和适当的阴性肽构成，例如 SEQ ID NO:29。
实例10:具有一个功能区的复合肽，其中存在两个表面吸附区， 一个在功能区的N末端， 一个在C末端，并且其中功能区包含两个 特定蛋白酶识别位点和两个连接体每个连接体是单个甘氨酸残基。 在一个实施方案中，蛋白酶识别位点针对肠激酶和凝血酶-SAR-肠激酶识别-连接体-凝血酶识别-连接体-SAR 在每种情况下，SAR代表适当的表面吸附区，例如SEQ ID NO: 10 和SEQ ID NO: 11。例如，功能区被编码为DDDDKGLVPRGSG (SEQ ID N0:32)，其中DDDDK (SEQ ID NO: 33)是肠激酶的识别位点，G是连 接体，LVPRGS (SEQ ID NO: 34)是凝血酶的识别位点，G是连接体。 代表性复合肽的氨基酸序列为
KKXAKKXGKKKAKKKGDDDDKGLVPRGSGKKKAKKKGKKXAKKKY (SEQ ID NO:35)
复合肽在中性pH下的净电荷强度/残基为+22/46 +0. 5。该例种 的多层膜由指定的阳性肽和适当的阴性肽构成，例如SEQ ID NO: 29。
实例11 :具有两个功能区的复合B;t其中存在三个表面吸附区， 一个在复合肽的N末端， 一个在C末端， 一个在两个功能区之间， 并且其中存在两个相同的功能区，用于形成天然肽交叉连接。
代表性的肽结构如下
SAR-功能区-SAR-功能区-SAR
其中如前，SAR是适当的表面吸附区，例如EEEAEEE (SEQ ID N0:36)，且该功能区含有特定数目的Cys残基，例如GGCGGCGG (SEQ ID N0:37)。代表性复合肽的氨基酸序列为
EEEAEEEGGCGGCGGEEEAEEEGGCGGCGGEEEAEEEY (SEQ ID NO:38)
复合肽在pH 7时的净电荷强度/残基为-0. 5。该例中的多层膜由 指定的阴性肽和适当的阳性肽构成，例如
KKKAKJOLGK阻KKKGKKKAKKKGKKKAKKKY (SEQ ED NO :39)
实例12:在多肽C末端包含一个功能区和一个表面吸附区的复 合多肽
该实例中，功能区是已知的蛋白质功能结构域，例如National Center for Biotechnology Information访问号AAP06461的BAG 结构域
BAG序列-EEEAEEEGEEEAEEEY (SEQ ID NO :40)
其中〃BAG序列〃代表来自日本血吸虫(Schistosoma japonicum) 的假设蛋白的BAG结构域的氨基酸序列 BAG序歹!j
SLQPEIDRFDGTPHSKEFKCLMENLEQLILSLDNLETDGNVEFRTMRRDAVKEIQ QLM EMLDYRSLISSQNDEVLAD (SEQ ID NO:41)
表面吸附区与SEQ ID NO: 13相同。
术语\"一个\"和\"一种\"和\"所述\"以及类似指示词的使用(特 别是在下述权利要求的上下文中)将解释为包括单数和复数，除非 本文以其他方式指明或与上下文明显矛盾。本文使用的术语第一、 第二等不是要指任何特定排序，而仅是为了方便表示多个例如层。
除非另有指明，术语\"包含\"、\"具有\"、\"包括\"和\"含有\"要 解释为开放型术语(即，表示\"包括但不限于\")。除非本文另有 说明，范围值的描述仅预期作为单独指落入所述范围内的每个单独 值的速记方法，并且如果每个单独值在本文单独叙述，则它被并入 本说明书。所有范围的端点包括在所述范围内，并可独立结合。本 文描述的所有方法可以以适当顺序进行，除非本文另有指明或者以 其他方式与上下文明显矛盾。除非另有声明，任何和所有实施例或 示例性语言(例如，\"例如\")的使用，预期仅为了更好地描述本 发明，并不对本发明范围产生限制。如本文使用的，本说明书的语 言都不应解释为表示任何为实施本发明所必需的非要求要素。
本发明的其他实施方案是可能的且可以做出调整而不偏离本发 明的构思和范围。因此，上面的详细描述不是要限制本发明。而且， 本发明的范围通过所附权利要求来限定。
权利要求
1.一种生产多层薄膜的方法，所述膜包含第一层和第二层，其中相邻层包含带相反电荷的聚电解质，所述方法包括共价结合一个或多个表面吸附区与一个或多个功能区，以生成复合多肽，其中所述复合多肽和所述一个或多个表面吸附区具有相同极性，其中所述一个或多个表面吸附区包含一个或多个氨基酸序列基序，所述基序由5至15个氨基酸残基组成并且在中性pH下具有大于或等于0.4的净电荷强度/残基，并且其中所述一个或多个功能区包含3至约250个氨基酸残基，其中所述复合多肽不是均聚物，长度至少为15个氨基酸残基，并且在pH 4至10范围内具有大于50μg/mL的水溶解度；以及将所述复合多肽沉积在基质或所述第二层上，以形成第一层；其中所述第二层包含第二层聚电解质，所述第二层聚电解质包含聚阳离子材料或聚阴离子材料，所述聚阳离子材料或聚阴离子材料具有大于1,000的分子量和每个分子至少5个电荷，以及一个与所述第一层聚电解质相反的电荷。
2. 权利要求1的方法，其中沉积步骤包括将所述复合多肽沉积 在基质上，并且进一步包括将所述第二层聚电解质沉积在所述第一 层上。
3. 权利要求1的方法，其中所述一个或多个表面吸附区和一个 或多个功能区通过溶液相合成、固相合成或重组肽生成而产生。
4. 权利要求l的方法，其中所述复合多肽具有大于或等于约1 mg/mL的水溶解度。
5. 权利要求1的方法，其中所述功能区包含功能基序，所述功 能基序包含3至约50个氨基酸残基，并且其中所述复合多肽在中性 pH下每个残基具有大于或等于0. 4的净电荷强度。
6. 权利要求l的方法，其中所述功能区是包含约50至约250个氨基酸残基的功能结构域。
7. 权利要求6的方法，其中所述功能结构域在pH 4至10下具 有大于50网/mL的水溶解度。
8. 权利要求6的方法，其中所述功能结构域在pH 4至10下具 有大于1 mg/mL的水溶解度。
9. 权利要求l的方法，其中所述聚阳离子材料包含聚胺。
10. 权利要求1的方法，其中所述聚阴离子材料包括核酸、藻 酸盐、角叉菜胶、帚叉藻聚糖、果胶、黄原胶、透明质酸、肝素、 硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸葡聚糖、聚甲基丙烯酸、 氧化纤维素、羧甲基纤维素、酸性多糖和含有侧链羧基的交联羧甲 基纤维素、合成聚合物和共聚物，以及包含一种或多种上述聚阴离 子材料的组合形式。
11. 权利要求l的方法，其中所述膜是微囊形式。
12. 权利要求ll的方法，其中所述微囊包含核心，并且所述核 心包含蛋白质、药物或其组合。
全文摘要
本文公开了包含两层或更多层聚电解质的多层膜，其中相邻层包含带相反电荷的聚电解质。第一层聚电解质包含复合多肽，所述复合多肽包含与一个或多个功能区共价连接的一个或多个表面吸附区，所述功能区生成单个多肽链。所述表面吸附区包含一个或多个由5至15个氨基酸残基组成的氨基酸序列基序。所述一个或多个功能区包含3至约250个氨基酸残基。
文档编号C07K17/00GK101365724SQ200680039950
公开日2009年2月11日 申请日期2006年10月25日 优先权日2005年10月25日
发明者D·T·海尼 申请人:路易斯安那科技大学研究基金会
本文链接： http://synthatexltd.immuno-online.com/view-762658.html
发布于 ： 2021-03-25
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